emberi

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • Új ligandum racionális megtervezése a szerkezeti vizsgálatokhoz.
  • A többdimenziós emberi SMO általános felépítése
  • Egyedülálló multi-domain interakció
  • Az emberi SMO összehasonlítása más frizz osztályú receptorokkal
  • Vita
  • Mód
  • A TC114 szintézise
  • Strukturális vizsgálatokhoz tervezett SMO-FLA fúziós konstrukció
  • Az SMO-FLA fúziós fehérje expressziója és tisztítása
  • Kristályosítás LCP-ben a Synchrotron adatgyűjtéshez
  • A szinkrotron adatgyűjtése és a struktúra meghatározása
  • Kristályosítás LCP-ben az XFEL adatgyűjtéshez
  • XFEL adatgyűjtés és struktúra meghatározása
  • Hidrogén-deutériumcsere tömegspektrometriás elemzés
  • MD szimuláció
  • Fehérje előkészítés és rendszer felépítése.
  • Molekuláris dinamikus szimuláció és adatelemzés.
  • Sün jelző teszt
  • Western Blot elemzés
  • Az adatok elérhetősége
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő információk
  • Peer review fájl
  • Hozzászólások

Tárgyak

  • Fejlődésbiológia
  • Nanokristallográfia

Összegzés

A kisimított receptor (SMO) a G-fehérjéhez kapcsolt receptor (GPCR) szupercsalád Frizzled osztályába tartozik, és a Hedgehog jelátviteli út kulcsfontosságú alkotóeleme. Itt bemutatjuk a multidomain humán SMO kristályszerkezetét, amelyet egy tervezett TC114 szerszámligandum köt meg és stabilizál, 2,9 Å szabad elektronröntgen lézerforrás felhasználásával. A szerkezet három különböző domén pontos elrendezését tárja fel: egy hét transzmembrán hélix domént (TMD), egy csukló domént (HD) és egy intakt extracelluláris ciszteinben gazdag domént (CRD). Ez az architektúra lehetővé teszi az alloszterikus interakciókat a ligandumok felismerése és a receptor aktiválása szempontjából fontos domének között. A strukturális adatok, a molekuladinamikai szimuláció és a hidrogén-deutériumcsere-elemzés kombinálásával megmutatjuk, hogy a transzmembrán helix VI, az extracelluláris 3 hurok és a HD központi szerepet játszik a jelátvitelben egy trigger mechanizmus segítségével. GPCR-ek.

Bevezetés

Eredmények

Új ligandum racionális megtervezése a szerkezeti vizsgálatokhoz.

A CRD csonka SMD-jét (ΔCRD-SMO) korábban több kismolekulával együtt kristályosították, beleértve az antagonistákat és a 3, 8, 9 agonistákat. Ezek a ligandumok és mások nem termeltek intakt CRD-t tartalmazó multi-domén SMO kristályait stabilizáló mutációk nélkül. A ΔCRD-SMO 3, 8, 9 korábbi struktúráinak elemzése azt sugallja, hogy egy több tartományból álló SMO kristályosodásához szükség lehet a szerkezet néhány speciális rugalmas részének stabilizálására. Például azt tapasztaltuk, hogy a 2. extracelluláris hurokban a β-hajtű tetején elhelyezkedő K395 részt vehet a szomszédos maradékokkal vagy 3. ligandumokkal való kölcsönhatásban, és ezért valószínűleg dinamikus konformációs állapotot vesz fel (1a. Ábra). Ezért feltételezzük, hogy e régió további stabilizálása egy meghatározott és erősebb interakció létrehozásával csökkentheti a konformációs heterogenitást.

( nak nek ) Az LY2940680 kötőrekesz közeli képe a ΔCRD - SMO szerkezetben (PBD ID: 4JKV). ( b ) Az LY2940680 analógok megtervezése és evolúciója az aromás gyűrű szubsztituenseinek variációjával történő kristályosodás tanulmányozásához. ( c ) Az LY2940680 és analógjai reprezentatív Tm értékei a CPM hőcserélési teszt szerint. ( d ) Közeli nézet a TC114 kötő zsebében. A ligandum megkötésében szerepet játszó TC114 (narancssárga szénatomok) és SMO maradékok (cián szénatomok) oszlopképben vannak ábrázolva. A vevő világoskék rajzfilm ábrán látható. A többi elem a következõ színû: oxigén, piros; nitrogén, sötétkék; kén, sárga. A hidrogénkötések szaggatott bíborvonalként jelennek meg.

Teljes méretű kép

A multi-domain SMO struktúráink elemzése azt mutatta, hogy a TC114 ligandumba bevezetett nitrocsoport erősen kölcsönhatásba lép a K395-tel az SMO-ban, ahogy tervezték, és javítja a benzoilcsoport és az F484 közötti π - π halmozódást a helix VI-ban (1d. Ábra). Ezért arra a következtetésre jutunk, hogy a TC114 stabilizálja a multidomain SMO-t azáltal, hogy a VI spirált stabil konformációban tartja, ami viszont fokozza a kiterjesztett ECL3 és a hidrofób CRD horony közötti hidrofób kölcsönhatást. Ezért a tervezett TC114 ligandum elérte a kívánt célt, szuperstabilizáló szerként működött a hőstabilitási tesztben, és lehetővé tette a többdimenziós SMO kokristályosítás tanulmányozását.

A multidomain emberi SMO általános felépítése

Az SMO általános szerkezete (2a. Ábra; Kiegészítő 4. ábra) egy GPCR 7TM kanonikus hajtogatást oszt meg egy amfipatikus VIII-as spirállal, amely párhuzamosan fut a membrán síkjával. A CRD egyenesen ül a TMD tetején, és egyik oldalán a 3 extracelluláris hurok (ECL3), a másikon pedig egy összekötő hurok (181–190 maradvány) támasztja alá. A CRD-t és a TMD-t a HD köti össze (191–220. Maradvány). Továbbá a szerkezet extracelluláris oldalán (2b. Ábra) a VI spirál négy α-spirális fordulaton túlnyúlik a membrán felületén, a VI spirál teteje pedig egy nem prolin fordulattal a CRD felé fordul, kinyúlva a hidrofób barázdája és kulcscsatlakozás összekapcsolása a CRD és a TMD között. A CRD (V107, L108, L112 maradékok), HD (V210 maradék) és ECL3 (V494, I496 maradványok) hidrofób zsebet képez (2c. Ábra). Korábban arról számoltak be, hogy ez a zseb egy 7, 19 oxiszterol-kötő helyet alkot .

( nak nek ) Az emberi SMO globális szerkezete a TC114 komplexben, XFEL-ben meghatározva. A TC114 narancssárga pálcikaként jelenik meg. A CRD, a Linker, a HD és a TMD rajzfilm narancssárga, sötétkék, ciánzöld és világoskék színnel van jelölve. A membrán határát narancssárga pontozott vonallal jelöltük. Az N-kapcsolt glikánok (NAG) zöld sávokban vannak feltüntetve. ( b ) Az SMO felülnézete az extracelluláris oldalról. Hidrofób zsebet alkot a hidrofób CRD horony és az ECL3 (tengeri fogantyú). ( c ) A CRD és az ECL3 kulcsfontosságú maradványai, amelyek meghatározzák a hidrofób zsebet, cián, illetve világoskék sávokban vannak feltüntetve.

Teljes méretű kép

Egyedülálló multi-domain interakció

Teljes méretű kép

Az emberi SMO összehasonlítása más frizz osztályú receptorokkal

( nak nek ) A CRF hFzd-4 (PDB ID: 5CL1) és mFzd-8 (PDB ID: 4F0A) CRD SMO (hSMO) egymásra helyezett struktúráinak oldalnézete. Az SMO, a hFzd-4 és az mFzd-8 rajzfilmekként világoskék, mészzöld és narancssárga színben vannak feltüntetve. A Wnt és a Norrin sötétszürke, illetve narancssárga rajzfilmekként vannak feltüntetve. Az mFzd-8 CRD palmitoilcsoportja tengeri szférákban látható. ( b ) 1. hely: A palmitoil-csoport közeli képe egymással kölcsönhatásban lévő maradékokkal, például narancssárga rudakkal. A palmitoil-csoport tengeri botokban látható. A hidrofób zsebet alkotó SMO-maradványok világoskék, az mFzd-8 narancssárga oszlopokban vannak feltüntetve. ( c ) 2. hely: Az SMO és a hFzd-4 CRD felülete. Norrin világos narancssárga rajzfilmben látható. A színváltozás a világosvöröstől a sötétvörösig a felület tulajdonságának változásának felel meg hidrofilről hidrofóbra. A horrzs kötőhelyét a hFzd-4 CRD felületén fekete pontozott kör jelöli, a megfelelő helyet szintén jelölve az SMO felületén.

Teljes méretű kép

Vita

Mód

A TC114 szintézise

80 mg (0,34 mmol) 4-nitro-2- (trifluor-metil) -benzoesav, szekunder amin N-metil-1- (4- (1-metil-1H-pirazol-5-il) -ftalazin-1- il) piperidin-4-amint (100 mg, 0,31 mmol) és N, N-diizopropiletil-amint (DIPEA, 60 mg, 80 μl, 0,46 mmol) 3 ml metilén-dikloridban kezelünk 1- [bisz (dimetilamino)) metilén] -1H-1,2,3-triazolo [4, 5-b] piridinium-hexafluor-foszfát 3-oxidok (HATU, 153 mg, 0,40 mmol). A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, majd sóoldat hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet háromszor metilén-dikloriddal extraháljuk. Az egyesített szerves fázist telített NaHC03-oldattal és sóoldattal mossuk egymás után, majd Na2S04 felett szárítjuk. Szűrés után az oldatot vákuumban bepároljuk, és a nyersterméket szilikagélen gyors oszlopkromatográfiával tisztítjuk, így kapjuk a TC114-et színtelen szilárd anyag formájában (82 mg, 49%). A magmágneses rezonancia képalkotása rotamerek keverékét mutatta.

Strukturális vizsgálatokhoz tervezett SMO-FLA fúziós konstrukció

Az emberi vad típusú (WT) SMO gént a Genescript szintetizálta, majd egy módosított pTT5 vektorba klónozták, amely tartalmaz egy HA szignálszekvenciájú expressziós kazettát, amelyet FLAG tag, 10 × His tag és egy dohánymaró vírus ( TEV)) proteáz-felismerési hely az N-terminálison a receptor szekvencia előtt, és további 10x His-tag a C-terminálison. Egy kis Flavodoxin-fehérjét (FLA, MW 16KD) 16 fuzionáltunk az ICL3-hoz P434 és S443 között, rétegezett PCR alkalmazásával. Az N 1–52 terminált és a C 559–787 terminált megcsonkították. Egyetlen E194M mutációt vezettek be a HD-be az építkezéshez, amelynek kristályait az XFEL-ben történő adatgyűjtéshez használták. A szinkrotronszerkezet meghatározásához használt konstrukció nem tartalmazza a pontmutációt, és némileg módosult az N-terminális további csonkolásával öt aminosavnál. Az ebben a vizsgálatban használt összes primer szekvenciát az 1. kiegészítő táblázat mutatja.

Az SMO-FLA fúziós fehérje expressziója és tisztítása

Kristályosítás LCP-ben a Synchrotron adatgyűjtéshez

Az SMO receptor fehérje mintákat a TC114-gyel komplexben lipid-köbös fázisban (LCP) rekonstruáltuk olvadt lipidekkel (10 tömeg/tömeg% koleszterin, 90 tömeg/tömeg% monoolein) 2/fehérje arányban történő keveréssel. 3. oldat (v/v)/lipidek mechanikus fecskendő-keverővel 29. Az LCP kristályosítási vizsgálatokat NT8-LCP kristályosító robot (Formulatrix) alkalmazásával végeztük 96 üregű üveg szendvicslemezeken (Nova). A beállítás után a lemezeket inkubáltuk, és képeket készítettünk 20 ° C-on egy automatizált képalkotó kamera/inkubátor segítségével (RockImager 1000, Formulatrix). A kezdeti kristályleleteket 100 mM nátrium-citrát-hárombázisú dihidrátot (pH 5,0, 30% (v/v) PEG400, 100 mM ammónium-nitrátot tartalmazó) kicsapó körülmények között találtuk. Az optimalizálás után a kristályok 100 mM nátrium-citrát-tribázikus dihidrátban (pH 5,0, 36% (v/v) PEG400, 50–200 mM ammónium-nitrát) nőttek az átlagos 47 × 23 × 8 μm 3 méretig 7 d alatt. Az SMO kristályokat közvetlenül az LCP-ből gyűjtöttük 30 μm-es mikromont (MiTeGen) alkalmazásával, és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk az adatgyűjtéshez.

A szinkrotron adatgyűjtése és a struktúra meghatározása

Teljes méretű asztal

Kristályosítás LCP-ben az XFEL adatgyűjtéshez

Az LCP-XFEL kristályait Hamilton gázzáró fecskendőkben állítottuk elő, a fentiek szerint 38 úgy, hogy kb. 400 μm átmérőjű folyamatos oszlopként ~ 5 μl fehérjével töltött LCP-t injektáltunk egy 100 μl-es fecskendőbe, amely 60 μl kicsapó oldattal volt tele. 100 mM nátrium-citrát-hárombázisú dihidrát, pH 5,0, 36% (v/v) PEG400, 150 mM ammónium-klorid és legalább 24 órán át 20 ° C-on inkubáljuk. A kristályok képződése után (5 × 5 × 2 μm 3 táptalaj) ), 2-3 fecskendőből származó mintákat konszolidáltunk, és a felesleges kicsapó oldatot eltávolítottuk. A visszamaradó kicsapódó oldatot néhány mikroliter megolvadt MAG 7,9 lipid 39 hozzáadásával abszorbeáltuk. A kapott kristályos LCP mintát vizuális mikroszkóp alatt megvizsgáltuk, és LCP 9 injektorba helyeztük az LCP-SFX adatgyűjtés céljából.

XFEL adatgyűjtés és struktúra meghatározása

Hidrogén-deutériumcsere tömegspektrometriás elemzés

MD szimuláció

Fehérje előkészítés és rendszer felépítése.

A koleszterin SMO receptor kristályszerkezetét a PDB adatbázisból kaptuk (PDB kód: 5L7D 20). A modell felépítéséhez a szerkezet A láncát választották. A Prime 45-et a Schrödinger 2015-3 kiadásában használták, és az ICL3-at homológiai modellel építették fel egy másik Smo kristályszerkezet felhasználásával (PDB kód: 4JKV (3. hivatkozás)), és a Prime megjósolta az ICL2 hurokot. A modellt a Prepwizard 46 finomította pH = 7,0 mellett, és a C vagy N terminált az ACT és az NME korlátozta.

Az SMO receptor transzmembrán domén körüli membránt 135 POPC molekula és 48 koleszterin készítette el a CHARMM-GUI 47 webszerver segítségével. Az utolsó periodikus határrendszer doboza 84,75 × 84,75 × 139,85 Å, és 20881 TIP3P vizet és 62 Na + és 68 Cl - iont (0,15 mol l -1 NaCl) használtunk a doboz szolvatálására és semlegesítésére. A rendszer periódusos sejtenként összesen 93 475 atomot tartalmazott.

Molekuláris dinamikus szimuláció és adatelemzés.

A bemutatott Amber99sb-ILDN 48 erőt az SMO receptorra, a TIP3P vízre és az ionokra, a Slipids 49 erőteret pedig a koleszterinre és a POPC-ra. A szimulációhoz a Gromacs 5.1.2-t (50. hivatkozás) használtuk, a relaxációs protokollt pedig a CHARMM-GUI-tól szereztük be, és írtuk le annak papírján és webszerverén. Először a rendszert a legmeredekebb süllyedési eljárással 10 000 lépéssel minimalizálják, és állandó hőmérsékleten (303,15 K) és állandó nyomáson (1,0 bar) egyensúlyba hozzák 50 ps NVT és 125 ps NPT körülmények között, szigorú korlátozásokkal a fehérjék és a lipidek között, és a meg nem kötött határértékkel 10–12 Å határértékek. Ezt követően 2 ns NPT egyensúlyát végeztük ugyanabban az állapotban, gyenge fehérje- és lipidkorlátozásokkal, hogy a kiegyensúlyozott fázist elérjük. Végül az 1000 ns termék két azonos MD szimulációját hajtottuk végre az SMO receptoron, a koleszterin pedig ligandumként a lipid és víz rendszerben.

A termék MD-szimulációjának eredményét a Gromacs 5.1.2 elemezte. A három atom által definiált szöget (P69, V210 és W535 C-alfa) választottuk az SMO CRD hajlásának leírására az SMO TMD vonatkozásában.

Sün jelző teszt

Light II sejteket (ATCC; Rockville, MD) 8x szentjánosbogár szentjánosbogár luciferáz stabil ektopiás expressziójával a Gli kötőhelyen és konstitutív Renilla luciferáz riporter konstrukciókat oltottunk 96 lyukú lemezekre. A simított vagy megkülönböztetett vad típusú sima mutáns plazmidokkal végzett transzfekció után a sejteket különféle kezeléseknek vetettük alá, 36 órán keresztül. A könnyű II sejtekben a luciferáz aktivitást a Promega Dual Luciferase Assay System Kit (a gyártó által adott luminométeren (Molecular Devices; Sunnyvale, CA) utasításai szerint) (Madison, WI) segítségével mértük, és azt a Renilla értékekre normalizáltuk. Az adatokat ábrázoltuk, és az IC50 értékeket a GraphPad Prism segítségével határoztuk meg. Mindegyik adatpont háromszorosban megismételt átlag ± sd értéket képvisel.

Western Blot elemzés

A sejteket különféle transzfekciók után összegyűjtöttük, és lízispuffernek vetettük alá (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM nátrium-vanadát, 1 mM PMSF, DTT 1 mM, 10 mg ml -1 leupeptin és aprotinin), amelyet immunoblot elemzés követ. Az SMO és a GAPDH elleni elsődleges antitesteket (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA) használtuk az immunblot elemzéséhez az 51. rutin eljárás szerint. Az SMO és a GAPDH elleni antitesteket 1: 200, illetve 1: 5000 arányban hígítjuk a gyártó utasításainak megfelelően.

Az adatok elérhetősége

A koordinátákat és a szerkezeti tényezőket az SMO-TC114 fehérjeadatbankjában raktuk le, XFEL-ben (PDB: 5V56) és szinkrotronban (PDB: 5V57) oldva. Ebben a vizsgálatban a 4JKV, 5L7D, 5L7I, 4QIM, 4QIN, 4N4W, 4O9R, 5KZZ, 5KZV, 5KZY, 5CL1, 4F0A PDB hozzáférési kódokat használták. Ebben a vizsgálatban az emberi SMO UniProt Q99835 hozzáférési kódjait használták. Minden más adat ésszerű kérésre a megfelelő szerzőktől áll rendelkezésre.

Kiegészítő információk

PDF fájlok

Kiegészítő információk

Kiegészítő ábrák, kiegészítő táblázat, kiegészítő módszerek és kiegészítő hivatkozások.

Peer review fájl

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja a közösségi feltételeket és irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.