melasztatin-ioncsatorna

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • A TRPM8 funkcionális expressziója makrofág populációkban
  • A TRPM8 modulálja a citokinek expresszióját a makrofágokban
  • A TRPM8 modulálja a makrofágok fagocita aktivitását és motilitását
  • A TRPM8 szerepe a makrofágokban a gyulladás összefüggésében
  • Vita
  • Mód
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő figurák
  • Kiegészítő adatok
  • Kiegészítő módszerek

Tárgyak

  • Sejtpusztulás és immunválasz
  • Vastagbélgyulladás
  • Monociták és makrofágok
  • Átmeneti receptor potenciális csatornák

Összegzés

Bevezetés

A makrofágok tekintetében már bebizonyosodott, hogy több TRP csatorna veszi a makrofágok működéséhez fontos jeleket. Például a TRPC3-ban hiányos makrofágok fokozott apoptózist és megváltozott efferocitózist mutattak ki, 9 és a TRPC6 felemelkedését figyelték meg krónikus obstruktív tüdőbetegségben szenvedő betegek alveoláris makrofágjaiban. Egér peritoneális makrofágjaiban (PM) a TRPV2 által közvetített részecskekötődés és fagocitózis szerepet játszott a lipopoliszacharid (LPS) által indukált citokintermelésben, míg a TRPV4 +/+ makrofágok helyreállították a tüdő érzékenységét a ventilátor által okozott mechanikai károsodásokra. 11, 12

Itt bemutatjuk, hogy az alkotmányosan expresszált TRPM8 aktiválása egér makrofágokban gyulladáscsökkentő citokin profilt indukál és fokozza a fagocitózist, míg a TRPM8 genetikai deléciója vagy farmakológiai blokkolása ellentétes hatásokat vált ki. Ezekkel a megállapításokkal összhangban a mentol beöntés védett volt a vad típusú (WT) egerekben, kísérleti vastagbélgyulladással, függetlenül a neuropeptid felszabadulás modulációjától, míg a TRPM8-hiányos egerek súlyosbított vastagbélgyulladást mutattak. A TRPM8-hiányos makrofágokkal feloldott egerek következetesen fokozott érzékenységet mutattak a vastagbélgyulladásra, ami kritikus szerepet játszott a TRPM8 konstitutív expressziójában a veleszületett immunitásban. Megállapítást nyert, hogy a TRPM8-hiányos makrofágok gyulladásgátló hatása in vitro és in vivo a tumor nekrózis faktor-α (TNF) -α és az interleukin (IL) -10 termelésének egyensúlyhiányától függ. .

Eredmények

A TRPM8 funkcionális expressziója makrofág populációkban

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

A TRPM8 modulálja a citokinek expresszióját a makrofágokban

TRPM8 által közvetített citokin expresszió moduláció egér peritoneális makrofágokban (PM). TNF-α felszabadulás ( nak nek ) és az IL-10 ( b ) vad típusú (WT) és TRPM8-hiányos (KO) PM 8 órás stimuláció után LPS-sel (100 ng ml -1) w/w/o mentollal (100 μM). A TRPM8 aktiválása gátolja a TNF-a-t, de fokozza az IL-10 felszabadulását WT-ben, de nem TRPM8-hiányos PM-t. Az adatok három kísérletből származnak (genotípusonként négy egér átlaga és fele három elemzésben elemezve. * P

A mentol beöntés megvédi a vad típusú WT C57BL/6 egereket a DSS vastagbélgyulladástól (2%). ( nak nek ) Azok az egerek, amelyeket napi kétszer mentol-beöntéssel kezeltek (100 µM), csak keveset fogytak a DSS-vastagbélgyulladás során a vivőanyag-kontrollhoz képest. Az adatok három kísérletre vonatkoznak, mindegyik csoport n = 6. * P 3,5 Ezután megmértük az egészséges és kolitikus egerekből izolált vastagbélek CGRP-felszabadulását (S5. Kiegészítő ábra). A TRPM8 agonisták mentol (100 µM) és icillin (33 µM) körülbelül ugyanolyan mértékben gátolták a mechanikusan indukált CGRP felszabadulást (90 Hgmm) az egészséges vastagbélben, mindkettő anélkül, hogy intrinsic hatást gyakorolt ​​volna a CGRP felszabadulásra. Érdekes módon a vastagbélből a gyulladt vastagbél kitágulása által okozott CGRP felszabadulás (2% DSS vastagbélgyulladás) önmagában erősen gyengült, ami a peptiderg szenzoros neuronok kimerülését/deszenzitizálását sugallja. A TRPM8 agonisták egyike sem mutatott hatást a mechanikusan indukált CGRP felszabadulásra ebben az állapotban.

A TRPM8 vastagbélgyulladásban betöltött általános szerepének további feltárása érdekében DSS colitist indukáltunk WT és TRPM8 KO egerekben. Amint azt ugyanazok a szűrőeszközök határozták meg, mint korábban, a TRPM8 KO egerek fokozott érzékenységet mutattak a vastagbélgyulladásra (5. ábra). A kontroll WT egerekhez képest a TRPM8 KO egerek nagyobb súlyt vesztettek (5a. Ábra), és a DSS-vastagbélgyulladás 7 napos kúrája során nagyobb számú knockout egér pusztult el (5b. Ábra). A TRPM8 KO egerek szintén nagyobb endoszkópos károsodást mutattak (5c. Ábra) és súlyosabb szövettani változásokat (5d. Ábra) a kontroll WT egerekhez képest.

Súlyos DSS-kolitisz (2%) TRPM8 (KO) hiányos egerekben a vad típusú (WT) egerekhez képest. ( nak nek ) A testsúlycsökkenés TRPM8-hiányos egereknél súlyosabb volt, mint a kontroll WT egerekben a DSS-kolitisz során ebben a külön kísérletben. Az adatok három kísérletre vonatkoznak, mindegyik csoport n = 6. * P

Összefoglalva megállapításaink szerint a TRPM8 potenciális célpontot jelent olyan gyulladásos állapotokban, amelyek általában makrofág funkcióval járnak (pl. Mikrobiális fertőzések), különös tekintettel a gyulladásos bélbetegségek kezelésére. A TRPM8 agonisták, például az icilin, a mentol és az eukaliptol beöntéseit vagy orális készítményeit alkalmazó klinikai vizsgálatoknak egyértelműeknek kell lenniük, mivel ezeknél a szereknél nem jelentettek súlyos mellékhatásokat. 42 Ezenkívül a borsmentaolaj alapú gyógymódokat már használják az irritábilis bél szindrómában szenvedő betegek fájdalomcsillapító, görcsoldó és karminatív hatásuk miatt; gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegek is részesülhetnek ezekből a hatásokból.

Mód

Részletekért lásd a Kiegészítő módszerek című részt.

Állatok. WT és TRPM8 mutánsokat (B6.129P2-Trpm8 tm1Jul/J, Jackson laboratórium, Bar Harbor, ME) 8–12 hetes korban mindkét nemből 43 C57BL/6 egeret használtunk. Valamennyi állatkísérletet az Állatvédelmi Hatóság jóváhagyta, Mittelfranken kerületi kormány, Ansbach, Németország.

Egér PM és csontvelőből származó makrofágok izolálása. Az előkészítéssel és a sejtek izolálásával kapcsolatos részletekért lásd a Kiegészítő módszereket. Amint azt korábban leírtuk, az eljárások biztosították, hogy a csatolt sejtek> 99% -a F4/80 + makrofág volt. tizenegy

Phagocytosis assay. Az a kutató, aki minden csoportban meghatározta a fagocita aktivitást, elvakult a genotípusoktól és a kezelési eljárásoktól. Az in vitro fagocitózist zimozán részecskék vagy Citrobacter rodentium alkalmazásával értékeltük; in vivo Fluoresbrite mikrorészecskéket (0,5 μl g −1; Polysciences, Eppelheim, Németország) használtunk a fagocitózis értékelésére.

Ratiometrikus [Ca 2+] i mérések. A tenyésztett egér PM és BMDM ratiometrikus [Ca 2+] i méréseit Fura-2 (5 μmol l -1) alkalmazásával lényegében az idegsejtekre vonatkozóan korábban leírtak szerint hajtottuk végre. 6 6

DSS-vastagbélgyulladás kiváltása, monitorozása és farmakológiai kezelés. A vastagbélgyulladást 2% DSS (molekulatömeg: 36 000-50 000 kDa; MP Biomedicals, Illkirch, Franciaország) hozzáadásával indukáltuk az ivóvízhez 1 hétig az előzőekben leírtak szerint. 6 Az endoszkópos vastagbélgyulladás pontozását a korábban leírtak szerint végeztük, egér endoszkópos vastagbélgyulladás-index (endoszkópos pontszám) alkalmazásával, amely öt paraméterből állt: széklet konzisztencia, nyálkahártya felület szemcséssége, látható fibrin exudátum, érrendszeri változások és ödémás vastagbélfal megvastagodása, melyet az átláthatóság elvesztése. 44 Minden paraméter 0 pontról (nincs) 3 pontra (súlyos) lett osztályozva.

A makrofágok in vivo kimerülése, örökbefogadó transzfer és helyreállítás. Ezt a módszert eredetileg Van Rooijen és Sanders írta le. Négy öt

Az IL-10 in vivo túlzott expressziója. Az IL-10 tartós in vivo expressziós expressziós konstrukcióját úgy állítottuk elő, hogy egér teljes hosszúságú cDNS-jét kódoló komplementer DNS (cDNS) fragmenst klónoztunk az AAV vírusba, a korábban leírtak szerint. 46 DNS-t izoláltunk Qiagen plazmid maxi készletek segítségével, amelyek tartalmazzák az endotoxin eltávolítási lépést. Ezt követően a DNS-t MiraClean endotoxin eltávolító készlettel (Mirus Bio, Madison, WI) kezeltük. A kezeléshez 10 μg konstrukciót adtunk Krebs-Ringer oldatban minden egérnek hidrodinamikus farokvénás injekcióval, a korábban leírtak szerint. 47 kontroll egér kapott kontroll IL-10-et nem kódoló plazmidot (ál).

Reaktív oxigénfajok kimutatása. Az in vivo multispektrális fluoreszcencia-analízishez a MAESTRO teljes testű fluoreszcencia letapogató rendszert (INTAS, Göttingen, Németország) alkalmaztuk, a közelmúltban leírtak szerint. 43 A ROS detektálást ROS Brite 700 nm festékkel végeztük a gyártó útmutatásai szerint (AAT Bioquest, Sunnyvale, CA).

Adatelemzés. A szám (n) a vizsgált állatok vagy sejtek számára utal. A számításokat a Statistica 7.0 (Statsoft, Tulsa, OK) és az Origin 7.0 (OriginLab, Northampton, MA) alkalmazásával végeztük. Az alkalmazott teszteket a szöveg és/vagy az ábrák jelölik.