A növényi eredetű vegyületek citotoxikus aktivitása és bioenergia-metabolizmusa közötti kapcsolat. Végső fokozatú projekt [Írja ide] Pablo Fuentes Orozco Biológiai Kar. Sevilla, 2015

kapcsolat

A szüleimnek és a nővéremnek, hogy motiváltak és hittek bennem abban a pillanatban, amikor elkezdtem ezt a karrier nevű projektet. Anyámnak köszönöm a szeretetet, amelyet átadsz nekem, és hogy minden szenvedélyedet belém fekteted. Apámnak köszönöm, hogy megtanítottad, mi a bátorság, és mert senki sem tudja, hogyan kell hallgatni, mint te. Szeretnék köszönetet mondani oktatómnak, Javier Ávilának, köszönöm, hogy türelemmel és lélekkel irányítottak, Elena Talerónak, Azahara Rodrígueznek és Antonio Alcaide-nak is, minden biztató mozdulatért, és hogy az időmet rendelkezésemre bocsátották. Végül, és nem utolsósorban, köszönet minden barátnak, aki velem volt ezekben az években, az első és utolsó érkezőknek, minden őrültnek, aki megcsinálja a napomat, és mindenkinek, aki hallgatott és támogatott, amikor nem vagyok ott senki. Köszönjük, hogy egy baráti társaságot családtá tettél. Köszönöm Kalise. Ha valami nagyon érdekel, küzdj érte. Ha falnak ütközik, menjen át rajta! Van valami, amit tudnod kell a kudarcról. Soha nem szabad hagynod, hogy megverjen. (Haddock kapitány)

TÁRGYMUTATÓ Rövidítések összefoglalása i ii I. BEVEZETÉS 1 1. Oxilipinák a Növényi Királyságban 1 1.1. Jasmonates. Biológiai funkciók 2 1.2. A metil-jazmonát rákellenes hatású szerként 3 2. Oxilipinek az állatvilágban 5 3. A rák jelenlegi állapota 6 II. CÉLOK 8 III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 9 1. Felhasznált anyag 9 1.1. Metil-jázmonát 9 1.2. Sejtkultúrák 10 2. In vitro vizsgálatok 11 2.1. A metil-jázmonát citotoxikus aktivitásának értékelése 11 2.1.1. Sulforhodamine B 11 módszer

2.2. Bioenergetikus anyagcsere vizsgálatok 12 2.2.1. ATP számszerűsítése 14 2.3. A metil-jázmonát gyulladáscsökkentő aktivitásának értékelése 14 2.3.1. Alfa-tumor nekrózis-faktor termelése 14 3. Statisztikai elemzés 15 IV. EREDMÉNYEK 16 1. A metil-jászmonát citotoxikus aktivitása 16 2. Citotoxikus mechanizmusok. A bioenergetikus anyagcserére gyakorolt ​​hatások 19 3. A metil-jászmonát gyulladáscsökkentő hatása 21 V. MEGBESZÉLÉS 23 VI. KÖVETKEZTETÉSEK 27 VII. BIBLIOGRAPHY 28

Rövidítések AA arachidonsav ADP adenozin-biszfoszfát AJ jázmonsav ANOVA varianciaanalízis ATP adenozin-trifoszfát CJ cisz-jazmonát COX-ciklooxigenáz DEX-dexametazon-DHA-dokozahexaénsav DMSO-dimetil-szulfoxid ELISA-vizsgálat immunabszorpcióval rák ICEN acid hatóanyag 50 gátló koncentráció 50 IL interleukin J2 metil 4,5-didehidrojasmonát J7 metil 5-klór-4,5-didehidrojasmonate LLC krónikus limfocita leukémia LOX lipoxigenáz LPS lipopoliszacharid MJ metil jázzmonát WHO egészségügyi világszervezet OPDA 12-oxo-fitodainsav OXLs oxilipinek pufferolt foszfát-sóoldat PMA forbol-acetát-mirisztát ROS oxigénreaktív fajok SRB szulfodamin B TCA triklór-ecetsav THP-1 humán akut leukémia monocita vonal TNF-α tumor nekrózis faktor alfa TRAIL TNF-α 2-DG-vel kapcsolatos apoptózis indukáló ligandum 2-dezoxi-D-glükóz én

1. ábra A jázmátok biológiai funkciói és jelzésük biotikus és abiotikus folyamatok által közvetítve. 1.2. Metil-jazmonát, mint rákellenes hatású szer. Az MJ egy természetes ciklopentanon (2. ábra), amely növényi stresszválasz hormonokként az oxilipin családba tartozik (Liechti és Farmer, 2002). Termelését különféle környezeti abiotikus jelek (UV-sugárzás, ozmotikus stressz és hőmérséklet-változás) és biotikus (kórokozók, növényevők) indukálják (Ryals et al., 1996; Beckers és Spoel, 2006; Van der Ent et al., 2009), és közvetíti a jelzést, amely aktiválja a védekező reakciókat az ilyen típusú stresszekkel szemben (Vasyukova et al., 2009). Amellett, hogy növényi másodlagos metabolitként működik, kiváltja a növényvédelmet, az MJ figyelemre méltó hatást gyakorol az emlős rákos sejtekre (Avdiushko et al., 1995; Kato et al., 1993; Melan et al., 1993; Fingrut és Flescher, 2002 ). A jasmonátok megváltoztatják a növény mitokondriális funkcióját, és reaktív oxigénfajok (ROS) képződését idézik elő, ami az emlősök apoptózisához hasonló úton sejthalálhoz vezet (Soares et al., 2010; Zhang és Xing, 2008). Megállapították, hogy az MJ-nek 3 van

II. CÉLKITŰZÉSEK A növényi jázmonátok kielégítő biológiai aktivitást mutattak a rák területén, a citotoxikus mechanizmusaiknak köszönhetően, amelyek az emberi rák különböző vonalaiban a sejthalál indukciójához kapcsolódnak. A metil-jazmonát (MJ) szinergikus kombinációban hasznosnak bizonyult a kolorektális rákhoz és bizonyos leukémia sejtvonalakhoz jelenleg használt gyógyszerekkel. Ezért ennek a kísérleti végfokú projektnek a fő célja az volt, hogy felmérje a növényi eredetű oxigén MJ potenciális biológiai aktivitását (rákellenes és gyulladáscsökkentő). Ezért ez a munka több konkrét célkitűzésre összpontosított: 1. A tiszta MJ vegyület citotoxikus aktivitásának vizsgálata a humán akut leukémia (THP-1) monocitikus vonalán, monocita és makrofág állapotban egyaránt. 2. Értékelje, hogy a citotoxikus mechanizmus zavarja-e a THP-1 sejtek bioenergetikai metabolizmusát monocita és makrofág állapotban. 3. A gyulladáscsökkentő aktivitás vizsgálata az MJ hatékonyságának tanulmányozásával a citokin TNF-α termelésében makrofágokká transzformált THP-1 sejtekben. 8.

III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 1. FELHASZNÁLT ANYAGOK 1.1. Metil-jázzonát E munka elvégzéséhez metil-jázmonátot (Sigma-Aldrich Química, S.L. Spanyolország) használtak, amelyet sötét körülmények között tartottak és 4 ° C-on tároltak. Felhasználás céljából ezt a terméket dimetil-szulfoxidban (DMSO) állították elő 4400 mm törzskoncentráció mellett. A vizsgálat különböző koncentrációit a megfelelő hígításokkal, teljes táptalajjal, majd ezt követően ultrahanggal kezeltük szobahőmérsékletű fürdőben a megfelelő homogenizálás érdekében. Mindenesetre a sejttenyészetekben a DMSO százaléka kevesebb volt, mint 1% a sejt életképességének biztosítása érdekében. munka. 1. táblázat: A tiszta MJ vegyület nomenklatúrája és szerkezete, amellyel ezt a 9-et elvégezték

1.2. Sejtkultúrák A munka elvégzéséhez használt sejtvonal egy emberi akut leukémia monocita sejtvonal, a THP-1 volt, ezt Francisco Muriana professzor adta szívesen a sevillai Instituto de la Grasa-ból (Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Sevilla). a Molekuláris és Alkalmazott Farmakológiai Csoportnak (FARMOLAP), amelyben e munka nagy részét elvégezték. A sejteket 37 ° C-on, 5% CO2 és magas páratartalom mellett atmoszférában tenyésztettük, RPMI 1640 táptalajban, 2 mM L-glutaminnal és 25 mM HEPES-sel (GIBCO, USA), 10% marha-magzati szérummal (PAA) kiegészítve. 1 penicillin/sztreptomicin (PAA). Ezt a sejtvonalat monocitás állapotában (szuszpenzióban növekedés) tartottuk, vagy a makrofágokká (tapadó állapot) való differenciálódását PMA-val (0,2 µm) indukáltuk 72 órán át. 3. ábra: A fordított fénymikroszkóp alatt megfigyelt THP-1 humán akut leukémia vonal. THP-1 sejtek monocita állapotban, 10X (A) célkitűzéssel; THP-1 sejtek makrofág állapotban, 40X objektívvel (B). 10.

Az SRB technikát elsősorban az MJ nem citotoxikus dózisainak kiválasztására alkalmazták a későbbi sejtjelzési és citokin expressziós vizsgálatokhoz. 4. ábra: A B szulforhodamin módszer által követett protokoll. 2.2. A bioenergetikus anyagcsere vizsgálata Az MJ-vel kezelt sejtek energia-anyagcseréjének tanulmányozásához az ATP-koncentráció értékelését elvégeztük az alkalmazott MJ-dózisok különböző értékeinél. Ezt az értékelést a THP-1 sejtvonalon végeztük, mind makrofág, mind monocita állapotban. Makrofág állapotban 10 000 sejt beoltásával végeztük 100 µl/üreg végtérfogatban. Ehhez steril 96-12 NUNC lemezeket használtunk.