Összegzés
A kis méret gyors fejlődése és a zebrafish átláthatósága nagy előnyöket jelent az 1-4. Fertőzés veleszületett immunszabályozásának vizsgálatában. Itt bemutatunk technikákat a zebrafish lárvák fertőzésére a patogén Candida albicans gombával. Mikroinjektálás útján a közelmúltban alkalmazott módszertan a NADPH-oxidáz fagociták aktivitásának a gombás dimorfizmus szabályozásában való részvételére vonatkozik 5 .
Absztrakt
A Candida albicans kórokozó által okozott disszeminált candidiasis klinikailag fontos probléma a kórházi betegeknél, és 30–40% -os mortalitásnak tulajdonítható. 6. A szisztémás kandidózist általában a veleszületett immunitás és a veleszületett immunsejt-összetevők genetikai hibáival rendelkező emberek irányítják. mint például a fagocita NADPH-oxidáz hajlamosabb a candidemia 7-9-re. A C. albicans és az immunsejtek közötti kölcsönhatás dinamikájáról in vivo nagyon keveset tudunk. Kiterjedt in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a gazdaszervezeten kívül a C. albicans a makrofágokon belül csírázik, és a 10–14-es neutrofilek gyorsan elpusztítják. Az in vitro vizsgálatok, bár hasznosak, nem tudják összefoglalni a komplexet lakókörnyezetben, amely magában foglalja a citokinszintek időfüggő dinamikáját, az extracelluláris mátrix kötődéseit és az intercelluláris érintkezéseket 10, 15-18. Ezeknek a tényezőknek a gazda-patogén kölcsönhatásban való részvételének vizsgálatához elengedhetetlen egy olyan modellszervezet megtalálása, amely intakt élő gazdaszervezetben nem invazív módon jeleníti meg a fertőzés ezen aspektusait.
A zebrafish lárvák egyedülálló és sokoldalú gerinces gazdaszervezetet kínálnak a fertőzés vizsgálatához. A fejlődés első 30 napjában a zebrafish lárváknak csak veleszületett immunvédelme van 2, 19-21, ami leegyszerűsíti a veleszületett immunitástól nagymértékben függő betegségek, például a disszeminált candidiasis tanulmányozását. A zebrafish lárvák kis mérete és átláthatósága lehetővé teszi a fertőzés dinamikájának leképezését sejtszinten, mind a gazda, mind a kórokozó szempontjából. Transzgénikus lárvák fluoreszcens immunsejtjei felhasználhatók a 22-24-es fertőzésben részt vevő specifikus sejttípusok azonosítására. A módosított antiszensz oligonukleotidok (Morpholinos) felhasználhatók különféle immunkomponensek, például fagocita NADPH-oxidáz leütésére és a gombás fertőzésre adott válaszváltozások tanulmányozására. A kis alsó gerinces alkalmazásának gyakorlati és etikai előnyei mellett a Zebra hal lárvák egyedülálló lehetőség a kórokozó és a gazdaszervezet közötti küzdelem intravitalis és színes ábrázolására.
A zebrafish-t számos emberi patogén baktérium fertőzésének modellezésére használták, és fontos szerepet játszott a mikobakteriális fertőzés megértésének fontos előrehaladásában 3, 25. A lárvák megfertőzésére azonban nemrégiben sokkal nagyobb kórokozókat, például gombákat használtak 5, 23, 26, és a mai napig nem volt részletes vizuális leírás a fertőzés módszertanáról. Itt bemutatjuk a zebrafish Prim 25 kamra hátsó agy mikroinjekciós technikáit, beleértve a korábbi protokollok módosítását. Eredményeink a gombás fertőzés zebrafish lárva modelljével különböznek az in vitro vizsgálatoktól, és megerősítik annak szükségességét, hogy az egyszerűsített Petri-csőrendszer helyett a komplex gépi környezetben vizsgáljuk meg a gazda-patogén kölcsönhatást 5.
Jegyzőkönyv
Az összes zebrafish-gondozási protokollt és kísérletet az Intézményi Állattartás és Foglalkoztatás (IACUC) A2009-11-01 protokollja alapján hajtották végre.
1. Morpholino és injekciós lárvaedények
Kísérlet időtartama: * (10-15 perc)
Nehézségi fok: *
- Tojásinjekciókhoz készítsen 2% -os agarózoldatot steril vízben és mikrohullámú sütőben. Amikor az oldat kihűlt, öntsön belőle egy extra mély Petri-csészébe (Fisher Scientific), amíg az félig meg nem telik. Hűtsük le jégben, és tegyük a tányért szintre.
- Miután a lemez kihűlt, a felső 15 ml 2% -os agarózréteget öntjük. Spray egy bordázott műanyag tojásinjekciós formát (Adaptive Tools of Science) steril vízzel egy spray palackból. Óvatosan helyezze a nyílást lefelé a forró agaróz formába. Amikor az agaróz kihűlt, használjon egy lapos fém spatulát (VWR Scientific), hogy elkülönítse a sablont az emelt AGA-tól. Fokozatosan távolítsa el a rácsot az agarózról. Csomagolja be az embrióinjekciós edényeket Parafilm-be (VWR Scientific), és fordítva tárolja 4 ° C-on.
- Hallárva injekciókhoz készítsen egy 2% -os agarózoldatot a leírás szerint. Öntsük az oldatot egy standard méretű Petri-csészébe (VWR Scientific), és tegyük félre szilárd állapotig. Tekerje be a Parafilm injekciós lárvák és a sátor lemezeit 4 ° C-on megfordítva.
2. Gombakultúra elkészítése
A kísérlet időtartama: ** (30 perc)
Nehézségi fok: **
3. Zebrafish fertőzések
Kísérlet időtartama: **** (1-3 óra)
Nehézségi fok: ****
4. A hal előkészítése a képen
A kísérlet időtartama: ** (30 perc)
Nehézségi fok: **
- Készítsük el a tricaine-metán-szulfonát-oldatot az előzőek szerint (200 mg/ml). Távolítsa el a fertőzött halakat, és vigye át tricaine-ba.
- Készítsen 47,9 ml 0,4% alacsony olvadáspontú agarózt (VWR Scientific) a tojásban és a vízben. Melegítsük fel az oldatot a mikrohullámú sütőben. Hűtsük 37 ° C-ra, és adjunk hozzá tricaine-metán-szulfonátot (200 mg/ml) a keverékhez
- Miután a halakat tricaine-metán-szulfonátban rögzítették, pipettázzon egyes halakat egy 0,4% alacsony olvadáspontú agarózt tartalmazó Petri-csészébe (VWR Scientific) (VWR Scientific).
- Ezután helyezze át az alacsony olvadáspontú agarózhalakat egy üvegfenekű lemez (MatTek Corporation) egyes lyukaiba képalkotás céljából. Használjon a lehető legkevesebb olvadáspontú agarózt, hogy a halak laposan feküdjenek a kapszula alján. Csak annyi tricaine-agarózt használjon, hogy kitöltse az üveg alsó lemezén lévő enner köröket.
5. A Jupiter protokollokkal kapcsolatos módosítások
Mikropipetták a mikroinjekcióhoz
Kísérlet időtartama: * (10-15 perc)
Nehézségi fok: *
- Húzza ki a BF120-69-10 (Sutter Instruments) üreges üvegrudakat egy lángoló barna P-97-es mikropipetta-extraktorral (Sutter Instruments) Yuan et al. 30. Válassza ki a 7. számú programot a következő hőviszonyokkal = 470, sebesség = 120, idő = 200. A kapott tű a kúptól a hegyéig 8 mm, és ha a hegy felett 3 mm-rel elvágja, akkor annak átmérője kb.
- Tegyen egy üveg mikropipettát a tartókra. Válassza a "Húzás" lehetőséget. A fűtőszálat a tűre melegítik a program paraméterei szerint, és az üvegrudat két kihúzott mikropipettára osztják. A mikropipettákat pipettatároló dobozban tárolják (Sutter eszközök).
Embrió gyűjtés, Morpholino injekció és karbantartás
Kísérlet időtartama: *** (1-2 óra)
Nehézségi fok: ***
Kísérlet időtartama: ***** (1-5 óra)
Nehézségi fok: ***
6. Reprezentatív eredmények
A fertőzés utáni 5 órában (HPI) és a HPI 24-ben egy sikeres rhombencephalon kamra C. albicans zebrafish lárvában mutat be példát. (1.ábra). Amint a makrofág sejtek burkolják a C. albicans-t, az agy hátsó kamrájában láthatók 5 hpi-nél. 24 hpi-nél a C. albicans a farok hátsó szövetében található makrofág-sejtekben található, amely disszeminált candidiasisra utal. Ez a fertőzés kimenetele nagymértékben függ attól, hogy 10-15 élesztőformájú C. albicans pontosan beinjektálódik-e az agy hátsó kamrájába. A fertőzött halak átvizsgálása az injekció beadása után biztosíthatja ezt.
1.ábra FLI1 transzgén:. Az EGFP 22, 33 lárva CaF2-yCherry Candida albicans-szal fertőzött és intravitalis módon konfokális mikroszkóppal készült. (CA) 5 órával a fertőzés után - (A) EGFP-vel fertőzött lárvák-makrofág expressziós sejtek a fertőzés helyén (rhombencephalon kamra) Méret oszlop = 100 mikron. (B és C) Ugyanazon halak nagyobb nagyítású képei, amelyek a C. albicans-t mutatják a fagocitákban. Skála sáv = 100 μm B és 10 μm C. (DF) esetén 24 órával a fertőzés után (D) CaF2-yCherry C. albicans-szal disszeminált kandidózissal fertőzött lárva, az EGFP makrofágszerű sejtjeiben, a szövet hátsó farkában. Méretarány = 100 mikron. (E és F) Nagyobb nagyítási képek ugyanazon halakról, a C. albicans látható a farokszövetben. Méretarány = 100 mikron.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Az itt bemutatott zebrafish mikroinjekciós módszer eltér Gutzman et al. A 34. ábra bemutatja, hogy itt a szemüreg-vezikulán keresztül az agy hátsó kamrájába történő 36–48 HPF-lárva injekciója látható. Módszer leírása 10-15 élesztő következetes injektálására a rhombencephalon kamrába, csökkent szövetkárosodás mellett. Ez a protokoll helyi fertőzést eredményez, amely kezdetben a testben 24 hpi-ben terjed. (1.ábra) és a szignifikáns letalitás/morbiditás eredményei 5. Az agy hátsó kamrája 48 HPF 27, 29-ig nem záródik le teljesen. A fejlődés ezen első szakaszában a makrofágok és a neutrofilek a fertőzés helyére vándorolnak, fagocitózzák a C. albicans-t, és átjuthat a test más részeire 5.
Ennek a rendszernek a valódi ereje abból a képességből fakad, hogy a transzgénikus zebrafish-t kombinálhatja a mikrobát expresszáló fluoreszcens fehérjével. Vad típusú és mutáns foltokat terveztünk a C. albicans-ból az mCherry, a dTomato és az eqFP650 konstitutív expressziójára. Ezeknek a expressziós konstrukcióknak az oxidatív stressz-válasz promoterekkel való kombinációja lehetővé teszi az oxidatív stressz radiometrikus számszerűsítését élő zebrafish lárvákban. 5. Fluoreszcens gombák és fluoreszcens veleszületett immunsejtek kettős in vivo képalkotása egy gombamutáns vagy morfáns hal összefüggésében is elvégezhető. olyan robusztusan megváltozott immunválaszok számszerűsítésére használják, mint a fertőzés helyére történő vándorlás, a kórokozó fagocitózisa, a gomba csírázásának megakadályozása és öt megölése.
A zebrafish lárvákat a mai napig alkalmazták a bakteriális kórokozókra, gombákra és vírusokra adott veleszületett immunválasz modellezésére, 5, 26, 35-46. Ezek az úttörő tanulmányok megalapozták e modellrendszer hasznosságát új sejtes és molekuláris mechanizmusok felfedezésében, mind a gazda, mind a kórokozó esetében. E leírt protokollal együtt ezek a más publikált munkák szolgálnak alapul más laboratóriumok számára a gazdaszervezet és a gomba kölcsönhatásának vizsgálatára egy ép gazdaszervezet keretében.
Bár ezekben a kísérletekben hasznos, az itt leírt FLI1: EGFP transzgénikus vonalnak megvannak a maga korlátai. Az FLI1 gén az endotheliális érrendszerben expresszálódik, a 22. makrofág-sejtek mellett. A vaszkuláris EGFP fluoreszcenciája gyakran megnehezítheti a C. albicans kimutatását a makrofág-sejtekben. Ezenkívül a makrofág sejtekben az EGFP expressziója a fertőzés után körülbelül 18-24 órával csökken, ami megnehezíti a kimutatást. A közelmúltban specifikus vonalas makrofágokat tettek közzé a transzgénikus zebrafish-ban, és számos előnyük van a makrofág-vizsgálatok modelljeként 23.
A leírt fertőzési technika számos, zebrafish-ban rendelkezésre álló, nagy teljesítményű genetikai és fluoreszcens mikroszkópos eszközhöz nyújt hozzáférési pontot. Kombinálható megfelelő transzgén halakkal és mesterséges C. albicans-szal, hogy lehetővé tegye a gazdaszervezet-patogén kölcsönhatás számos aspektusának számszerűsítését, ideértve a C. albicans-t tartalmazó neutrofilek és makrofágok számát, a C. albicans emésztés gyakoriságát és a C felosztását albicans, az immunsejteken belül 5. Ez a protokoll kombinálható morfolino antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával is, hogy teszteljék az egyes veleszületett immungének szerepét a fertőzésben 5.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Közzétételek
Nincsenek összeférhetetlenségi nyilatkozatok.
Köszönetnyilvánítás
A szerzők köszönetet mondanak Dr. Carol Kim laboratóriumának a mikroinjekciós tréningért, Clarissa Henrynek az embriókészítés felgyorsításával és a készletek használatával kapcsolatos tanácsért, valamint Nathan Lawsonnak az FLI1: EGFP halak közreműködéséért. Köszönjük Wheeler és Shawn Paredes laboratóriumi tagoknak a kézirat kritikus elolvasását. Ezúton is szeretnénk megköszönni Mark Nilannak a halápolást és tanácsokat, valamint Ryan Phennicie-nek és Gabor Cristinának a projekthez kapcsolódó technikai tanácsokat. Ezt a munkát a K. Brothers MAFES kutatási asszisztensének támogatásával, az E08913-08 MAFES Hatch Grant támogatásával és R. Wheeler NIH CNRR P20RR016463 díjával finanszírozták.