A KOLBIAI NÖVÉNYEK ALAPVETŐ OLAJ-ALKATRÉSZEINEK TEVÉKENYSÉGÉNEK ÉRTÉKELÉSE A Trypanosoma cruzi ÉS a Leishmania spp LAURA VIVIANA HERRERA SANDOVAL UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER EGÉSZSÉGÜGYI MAESTRIA FAKULTÚRA 1
A KOLBIAI NÖVÉNYEK ALAPVETŐ OLAJ-ALKATRÉSZEINEK TEVÉKENYSÉGÉRTÉKELÉSE A Trypanosoma cruzi ÉS a Leishmania spp LAURA VIVIANA HERRERA SANDOVAL ELŐZMÉNYEK A diplomás munka a következő cím megszerzésének követelményeként került bemutatásra: MASTER BASIC BIOMEDICAL SCIENCES MASTER, PATRICIA.PATRICIA. UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER EGÉSZSÉGÜGYI MESTER KAR AZ ALAPBI ORSZÁGOS ORVOSI TUDOMÁNYOKBAN BUCARAMANGA 2011 2
DEDIKÁCIÓ Ha a füled a bölcsesség felé hajlik, és a szíved átadja az intelligenciának; ha felhívja az intelligenciát és észlelést kér; Ha úgy keresed, mint ezüst, mint egy elrejtett kincs, akkor megérted az Úr félelmét, és megtalálod Isten ismeretét. Mert az Úr bölcsességet ad; a tudás és a tudás árad ajkáról Példabeszédek 2: 2-6 Istenhez, aki mindent meg tud tenni. 6.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Oktatómnak, Dr. Patricia Escobarnak, óriási együttműködéséért, útmutatásáért, támogatásáért és mindenekelőtt türelméért a munka során végzett képzési és fejlesztési folyamatom során. Dr. Elena Stashenkónak és CENIVAM munkacsoportjának: Camilo, Deyanira és William a nyújtott információért és technikai támogatásért. A COLCIENCIAS-nak, hogy finanszírozza ezt a munkát a CENIVAM Kutatási Kiválósági Központon keresztül (CO-szám: 432-Colciencias). A kemoterápiás laboratórium munkatársainak, különösen Sandra Lealnek technikai és tudományos támogatásáért. Minden embernek: családnak, barátoknak, kollégáknak és tanároknak, akik valamilyen módon hozzájárultak e munka végrehajtásához. 7
TARTALOM Oldal BEVEZETÉS. 17 1. A PROBLÉMA MEGÁLLAPÍTÁSA. 20 2 INDOKOLÁS. 22 3 VIZSGÁLATI KÉRDÉS. 24 4. ELMÉLETI KERET. 25 4.1 Chagas-kór. 25 4.1.1 Általános. 25 4.1.2 A parazita 27 4.1.3 Kezelés. 27 4.2 LEISHMANIASIS. 30 4.2.1 Általános. 30 4.2.2 A parazita. 32 4.2.3 Kezelés. 33 4.3 FŐOLAJOK (ES) ÉS ALKATRÉSZEIK. 38 4.3.1 Általános. 38 4.3.2 Kémiai összetétel. 38 4.3.3 Biológiai aktivitás. 42 5. A MŰVÉSZET ÁLLAMA. 44 6. CÉLOK. 47 6.1 Általános cél. 47 6.2 Specifikus célok. 47 7. MÓDSZERTAN. 48 10
7.1 Módszertani tervezés. 48 7.2 Illóolajok (EA). 48 7.2.1 Gyűjtés, jellemzés és összetétel. 48 7.2.2 Az AE kiválasztása. 49 7.3 Az alkalmazott EA-k fő alkotóelemei. 55 7.4 Referencia-gyógyszerek. 59 7.5 Alap- és munkaoldatok elkészítése. 59 7.6 Paraziták és emlőssejtek. 59 7.7 Az emlőssejtek toxicitási tesztje. 60 7.8 Aktivitási tesztek T. cruzi-ban. 60 7.8.1 Aktivitás extracelluláris formákban. 60 7.8.2 Aktivitás intracelluláris amasztigótákban. 61 7.9 Tevékenységi kísérletek Leishmániában. 61 7.9.1 Aktivitás extracelluláris formákban. 61 7.9.2 Aktivitás intracelluláris amasztigótákban. 61 7.10 Az eredmények elemzése. 62 8. EREDMÉNYEK. 72 8.1 Eredmények a komponensek és az EA kiválasztásában. 72 8.2 A komponensek aktivitása emlős sejtekben. 74 8.3 Aktivitás T. cruzi-ban. 76 8.3.1 Az alkatrészek aktivitása. 76 8.3.2 Az alkatrészek aktivitása a Nifurtimox vonatkozásában. 76 8.3.3 A T. cruzi komponenseinek aktivitása a Vero sejtekkel szemben. 77 8.4 Tevékenység Leishmániában. 79 11
8.4.1 Az alkatrészek aktivitása. 79 8.4.2 A referencia gyógyszer aktivitása. 79 8.4.3 A Leishmania aktivitás és a THP-1 sejtek viszonya. 80 8.5 Komponens aktivitás összehasonlítása T. cruzi és L. chagasi esetében. 83 8.6 A komponens aktivitásának kapcsolata az azt tartalmazó EA-val: aktivitási index (IA). 83 8.7 Az aktív komponensek kemo-számítógépes elemzése. 89 9. VITA. 91 10. KÖVETKEZTETÉSEK. 98 11. BIBLIOGRÁFIA. 101 12
ÁBRÁK FELSOROLÁSA 1. ábra: A Trypanosoma nemzetség parazita formái 28 ábra 2. ábra: A Trypanosoma Cruzi életciklusa 30 3. ábra: A Leishmania nemzetség életciklusa 35 4. ábra: Illóolajok aromás komponenseinek kémiai szerkezete 40 5. ábra. Példák az AE 41 terpének kémiai szerkezetére 6. ábra: Példák az AE 41 szeszkviterpének kémiai szerkezeteire 7. ábra. A vizsgálat első szakaszában alkalmazott módszertani tervezés 50 8. ábra A vizsgálat második szakaszában alkalmazott módszertani tervezés 51 ábra 9. A Lippia nemzetség illóolajainak kiválasztott komponenseinek relatív mennyisége 73 10. ábra: A Piper nemzetség illóolajainak kiválasztott komponenseinek relatív mennyisége 74 13
TÁBLÁZATOK FELSOROLÁSA 1. oldal 1. táblázat: A Leishmania nemzetség taxonómiai osztályozása 34 2. táblázat: Az AE és fő összetevőinek Leishmania és T. cruzi fajokkal szembeni aktivitásának vizsgálata 46 3. táblázat: Az AE száma parazitaellenes aktivitásuk szerint 49 4. táblázat: Családok a T. cruzi és az L. chagasi esetében leggyakrabban előforduló AE 52 5. táblázat: T. cruzi és L. chagasi esetében aktív illóolaj nemzetségek 52 6. táblázat: A vizsgálatban kiválasztott és T. cruzi és L esetében aktív aromás növények AE azonosítása chagasi 54 7. táblázat: A kiválasztott aktív illóolaj-összetevők kémiai jellemzői 56 8. táblázat: A vegyületek in vitro aktivitásának osztályozási kritériumai 63 9. táblázat: A Lippia nemzetség AE kémiai összetétele 64 10. táblázat: Nemes Tagetes 66 11. táblázat: A Piper nemzetség AE kémiai összetétele 68 12. táblázat: Komponensek aktivitása emlőssejtekben 75 13. táblázat: Komponensek aktivitása T. Cruziban 78 14
14. táblázat: Komponensek aktivitása L. chagasi-ban 81 15. táblázat: Komponensek aktivitása L. Panamensis-ben 82 16. táblázat: Apinene aktivitási indexei 85 17. táblázat: Carvacrol aktivitási indexei 86 18. táblázat: Timol 87-es aktivitási mutatói 19. táblázat: 19. táblázat A transz-β-kariofillén aktivitásának 88 88. táblázat: A vizsgált összetevők toxicitási kockázatának előrejelzése 90 21. táblázat. A jelen vizsgálatban értékelt illóolajok összetevőinek biológiai aktivitásának elemzése 100 15
RÖVIDÍTÉSEK FELSOROLÁSA Illóolajok AmB Amfotericin B CC 50 Citotoxikus koncentráció 50 CC 90 Citototoxikus koncentráció 90 CI 50 Gátló koncentráció 50 CI 90 Gátló koncentráció 90 CENIVAM Nemzeti Kutatóközpont trópusi gyógynövényes aromás növényfajok agro-iparosításához DE Szokásos eltérés DMSO Dimethylsulfoxide IA Aktivitási index IS Szelektivitási index LC Bőr leishmaniasis LV Visceralis leishmaniasis MTT (3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2-difeniltetrazolium-bromid) NC Nincs számítva ND Nincs meghatározva NFX Nifurtimox NT Nem mérgező PBS Foszfátpuffer sóoldat PMA Phorbol-mirisztát-acetát 16
paraziták aktivitása. Annak érdekében, hogy összehasonlítsuk a komponens aktivitását az azt tartalmazó EA aktivitásával, kiszámoltuk az Aktivitási Indexet (AI), amelyet az EA parazitákban való aktivitásának és a komponens sejtekben való aktivitásának arányaként határozunk meg. Az összetevőket az aktivitás kritériumai szerint osztályozták, és statisztikai teszteket végeztek, hogy megállapítsák aktivitásuk jelentős különbségeit: a vegyületek típusa, a paraziták típusa és az életmód (szabad vagy sejten belüli), a sejtek típusa és a referencia gyógyszer, a p értékeket