stabilizálja

  • Összegzés
  • Cél:
  • Mód:
  • Eredmények:
  • Következtetés:
  • Bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • Állatok és kísérleti tervezés.
  • A szövetek összegyűjtése és feldolgozása.
  • Biokémiai elemzés
  • Szövettani és immunhisztokémiai festés.
  • TdT által közvetített nikkel dUTP jelölési vizsgálatok in situ
  • Western blotok
  • statisztikai elemzés
  • Eredmények
  • A TLR2 aktivitás blokkolása csökkenti és stabilizálja a brachiocephalic artéria ateroszklerotikus elváltozásait
  • A TLR2 blokád gyengíti az érelmeszesedéses artériák gyulladását
  • A TLR2 blokád csökkenti a makrofág apoptózist és a CHOP expressziót előrehaladott ateroszklerotikus elváltozásokban
  • A TLR2 közvetíti a felgyorsult ateroszklerotikus képződést, és szabályozza a CHOP expressziót és az apoptózist ApoE-hiányos egerekben, amelyek HC-diétával táplálkoznak
  • Vita
  • Szerző hozzájárulás

Összegzés

Cél:

A Toll-szerű receptor 2 (TLR2) szignalizáció kritikus szerepet játszik az érelmeszesedés megindulásában. A tanulmány célja annak megvizsgálása volt, hogy a TLR2 aktivitás blokkolása terápiás hatást fejthet-e ki előrehaladott érelmeszesedésre.

Mód:

Negyven hetes korban az apolipoprotein E (ApoE -/-) hiányos egereket normál étrenddel etették intravénásán TLR2 semlegesítő antitesttel vagy izotípus kompatibilis IgG-vel 18 héten keresztül. ApoE -/- Tlr2 -/- kettős találatú egereket vettünk pozitív kontrollként. A kezelések végén megmértük a plazma lipidszintjét és elemeztük a plakk morfológiáját, a gyulladásgátló citokin expressziót és az artériák apoptózisát. A vizsgálat második részében a 6 hetes ApoE -/- és ApoE -/- Tlr2 -/- egerek 12–24 hétig magas koleszterintartalmú étrendet fogyasztottak, a TLR2 és az apoptotikus markerek expressziós szintje az artériákban megvizsgálták.

Eredmények:

A TLR2 aktivitás blokkolása a TLR2 semlegesítő antitesttel vagy a Tlr2 gén inaktiválása nem változtatta meg az ApoE// - egerek plazma lipidszintjét. A farmakológiai és genetikai manipulációk azonban jelentősen csökkentették a lepedék méretét és az erek szűkületét, és megnövelték a plakk stabilitását a brachiocephalicus artériákban. A TLR2 antagonizmus védőhatásai az IL-6 és TNF-α gyulladásgátló citokinek elnyomott expressziójával és az NF-κB és Stat3 transzkripciós faktorok inaktiválásával társultak. Ezenkívül a TLR2 aktivitás blokkolása gyengíti az ER stressz által kiváltott makrofág apoptózist a brachiocephalic artériákban, ami elősegítheti a nekrotikus magok feloldódását előrehaladott érelmeszesedésben. Továbbá a magas koleszterinszintű étrend hangsúlyosabban felgyorsította az ateroszklerotikus képződést és fokozta a pro-apoptotikus CHOP fehérje expressziót és apoptózist ApoE -/- egerekben, mint ApoE -/- Tlr2 -/egerekben - .

Következtetés:

A TLR2 aktivitás farmakológiai vagy genetikai blokkolása csökkenti és stabilizálja az előrehaladott érelmeszesedést az ApoE -/- egerekben. Ezért a TLR2 jelátvitel megcélzása ígéretes terápiás stratégia lehet az előrehaladott érelmeszesedés ellen.

Bevezetés

Az érelmeszesedés a szív- és érrendszeri betegségek gyakori oka. A szív- és érrendszeri betegségek a legfőbb halálokok, és az egész világon egyre nagyobb veszélyt jelentenek az emberi egészségre 1. Az epidemiológiai és kísérleti vizsgálatok meghatározták a gyulladás túlsúlyát az érelmeszesedés minden szakaszában, a korai stabil ateroszklerotikus plakkok kialakulásától a fejlett plakkokig, amelyek hajlamosak a 2, 3, 4, 5 repedésre. A közelmúltban számos tanulmány foglalkozott a farmakológiai beavatkozásoknak a fejlett plakkok stabilitására gyakorolt ​​hatásával, mivel az instabil elváltozások megrepedése hozzájárul az akut koronária szindrómához 4, 6, 7. Az instabil plakkokat nagy lipiddel töltött nekrotikus magok jellemzik, amelyeket vékony rostos réteg zár be, magas szintű gyulladásgátló mediátorok és mátrix proteázok, valamint apoptózis. Az instabil plakkok kialakulása összefügg a veleszületett és adaptív immunrendszer részvételével.

Az autópálya-szerű receptorok (TLR) a mintázatfelismerő receptorok családja, amelyek kulcsszerepet játszanak a veleszületett immunitásban és gyulladásos reakciókat indítanak el. Ezen receptorok ligálása megindítja a κB (NF-κB) nukleáris faktor aktiválódását, ami a gyulladásos gének 8, 9 széles körének expresszióját eredményezi. A jellemzett TLR-ek közül a TLR2 egyedülálló, mivel képes TLR1-gyel vagy TLR6-tal heterodimerizálni, ami viszonylag széles ligandusspecifitást eredményez, amely magában foglalja mind az endogén, mind az exogén ligandumokat. Figyelemre méltó, hogy az összes potenciális endogén TLR2 agonista, beleértve a biglikán, a nagy mobilitású kromoszomális box fehérje 1 (HMGB1) és az oxidált lipoprotein komponenseket, megtalálható a 12., 13., 14. érelmeszesedésben. Ezenkívül a TLR2 jelátviteli út társul az endoplazmatikus retikulum (ER) stresszválaszához. Az ER stressz növelheti a TLR2 expressziót in vitro és in vivo, és a TLR2 hozzájárul az apoptózishoz azokban a makrofágokban, amelyek lipid által kiváltott ER stresszen mennek keresztül. Ezért a TLR2 potenciális célpont lehet az érelmeszesedés kezelésében alkalmazott terápiás beavatkozások során.

Anyagok és metódusok

Állatok és kísérleti tervezés.

Az ApoE -/- Tlr2 -/- egereket ApoE -/- egerek (C57BL/6 háttér, Jackson Laboratory) és Tlr2 -/- egerek (C57BL/6 háttér, Jackson Laboratory) heterozigóta keresztezéséből állítottuk elő. A homozigóta kettős knockout vagy ApoE egyszeres knockout egerek genotípusait PCR-rel igazoltuk, amint azt korábban leírtuk 18. Valamennyi állatot normál páratartalom, szobahőmérséklet és sötét fény ciklusban helyezték el, a vízhez és az élelemhez tetszés szerint hozzáférhettek. A vizsgálatokat az állatgyógyászati ​​és állatgyógyászati ​​kutatások etikai intézményi bizottsága (Peking, Kína) által felvázolt elveknek megfelelően végezték.

A szövetek összegyűjtése és feldolgozása.

Miután az egerek 4 órán át éheztek, a retorbitális vénás plexuson keresztül vért nyertünk a lipidméréshez. Ezután az egereket 50 mg/kg ip pentobarbitál alkalmazásával altattuk, és a bal szívkamrán keresztül fiziológiás nyomáson jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal perfundáltuk. Az aortákat gyorsan kivágtuk, az aortaívtől a csípő elágazásáig lefagyasztottuk, és a fehérje elemzése előtt -80 ° C-on tartottuk. Minden állat teljes brachiocephalikus artériáját 4% paraformaldehidben rögzítettük 24 órán át 4 ° C-on, paraffinba ágyazva és sorozatosan (5 μm vastagságban) metszettük.

Biokémiai elemzés

Az összkoleszterin, a nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-C), az alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin (LDL-C) és a trigliceridek szintjét a plazmában kereskedelmi készletek (Biosino, Peking, Kína) segítségével határozták meg a gyártó utasításai szerint. .

Szövettani és immunhisztokémiai festés.

A soros metszetek minden ötödik szakaszát módosított Movat pentakróm festéssel vagy Sirius vörös színnel festettük a brachiocephalicus artériában lévő fejlett ateroszklerotikus plakkok összetételének és stabilitásának értékelésére, és egérenként 12-15 metszetet elemeztünk minden egyes foltra. A festett részeket 200x-os nagyítással fényképeztük, és szakaszonként 2-3 látómezőt rögzítettünk és elemeztük az Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA, USA) alkalmazásával. Az összes szakasz átlaga az egér ateroszklerotikus elváltozását jelentette.

Immunhisztokémiai festéshez egérenként a brachiocephalicus artéria legalább 4 szakaszát inkubáltuk egy patkány anti-egér makrofág antitesttel (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), egy monoklonális antitest egérrel a simaizom számára. aktin (α-SMA, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) vagy egy nyúl anti-mátrix metalloproteináz (MMP) -2 antitest (1: 100, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság). A megkötött antitesteket peroxidázhoz kötött másodlagos antitestekkel komplexáltuk és diaminobenzidin alkalmazásával detektáltuk. A festett metszeteket 200x-os nagyítással fényképeztük, és 2-3 látómezőt vettünk fel, amelyek az egyes szakaszok teljes lézióterületét tartalmazzák, és elemezték az Image-Pro Plus 5.0 alkalmazásával. Az összes szakasz átlaga a célfehérjék expresszióját jelentette az érelmeszesedéses elváltozásban.

A makrofágok együttes elhelyezkedésének és a homológ fehérje C/EBP (CHOP) értékeléséhez patkány anti-egér makrofág antitestet (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) ÉS egér monoklonális antitestet a CHOP-hoz (1).: 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) használtuk primer antitestként. Egérenként négy szövetmetszetet inkubáltunk Alexa 647-jelölt csirke patkány és Alexa 488-jelölt nyúl anti-egér szekunder antitestekkel (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A metszeteket E2000U konfokális mikroszkóppal készítettük és Leica TCS SP2 szoftverrel értékeltük.

In situ TdT-közvetített nikkel dUTP jelölési vizsgálatok

Az ateroszklerotikus elváltozásokban az apoptotikus sejteket TdT-közvetített dUTP nick-end jelölési technikával (TUNEL) detektáltuk kitek felhasználásával (Promega, Madison, WI, USA). Az atommagokat DAPI-val festettük. A TUNEL-pozitív magokat egy Olympus I720 invertált fluoreszcens mikroszkóp alatt számláltuk. A makrofágok együttes elhelyezkedésének értékeléséhez a makrofágokat patkány anti-egér makrofág antitest (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) alkalmazásával detektáltuk, majd egy csirke patkányellenes szekunder antitestet használtunk, amelyet Alexa 647-gyel tárcsáztunk. (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA).

Western blotok

A szöveti homogenizálás után az extrahált fehérjéket 12% SDS-PAGE alkalmazásával elválasztottuk, és specifikus cápával immunblotoltuk, beleértve anti-MMP-2-t (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), anti-foszfo-NF-κB p65, anti-NF-kB p65 anti-hasított kaszpáz-3, anti-CHOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-foszfo-Stat3, anti-Stat3, anti-interleukin (IL) -6, anti-IL-10 vagy anti -tumor nekrózis faktor (TNF) -α (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). A másodlagos antitest szignálokat ECL Plus Western Blot Reagensekkel (Amersham Biosciences, PA, USA) detektáltuk a gyártó utasításainak megfelelően.

statisztikai elemzés

Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be. A különféle csoportok összehasonlítását egyirányú ANOVA-val végeztük SPSS segítségével. A normál eloszlást nem bizonyító adatokat Mann-Whitney U teszttel elemeztük. P

A TLR2 aktivitás blokkolása nem befolyásolja a plazma lipidszintjét. Az összes koleszterin (A), a triglicerid (B), az LDL-C (C) és a HDL-C (D) szintjét sóoldattal, IgG-vel vagy iv. TLR2ab-tal kezelt 58 hetes ApoE -/- egerekben határoztuk meg 18 éven át. héten és TLR2 (DK) hiányos ApoE -/- egerekben Chow-étrendet tápláltak. Az adatok átlag ± SEM-ként jelennek meg (n = 12 egér/csoport).

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

A TLR2 blokkolása csökkenti és stabilizálja az előrehaladott érelmeszesedést a brachiocephalicus artériában. (A és B) A Movat-festés megmutatta a sóoldattal, IgG-vel és TLR2ab-nal kezelt és TLR2-hiányos csoportok előrehaladott elváltozásainak összetételét. A nyilak a média erózióját jelzik. A skálasávok 200 μm-t képviselnek az A panelen és 50 μm a B panelen. A TLR2ab beadása 18 héten át és a TLR2 hiány jelentősen csökkentette az átlagos elváltozás területét (C), a maximális elváltozás szűkületét (D), a maximális nekrotikus magot/lepedéket (E) és a minimumot közepes vastagságú (F) ApoE-hiányos egerekben. L, lumen; M, média. Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be (n = 10 egér/csoport). b P

A TLR2 blokád stabilizálja a fejlett ateroszklerotikus plakkokat. A TLR2ab-nal kezelt és a TLR2-hiányos csoportokban a Sirius vörös festés magasabb kollagéntartalmat (A) mutatott ki. Az immunhisztokémiai festés a simaizomsejtek (B) nagyobb eloszlását és a makrofág-akkumuláció csökkenését (C) mutatta ki a brachiocephalicus artéria elváltozásaiban. A skálasávok 50 µm-t jelentenek. L jelzi a fényt. Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be (n = 10 egér/csoport). b P c P

A TLR2 blokkolása gátolja az érgyulladást az érelmeszesedéses artériákban. Az MMP-2 (A és B) expressziója, az NF-KB p65 (C) foszforilezése, a Stat3 (D) foszforilezése és az IL-6, TNF-a és IL-10 (E) citokinek expressziója csökkentek a TLR2ab-kezelt és a TLR2-hiányos csoportokban. A skálasávok 50 µm-t képviselnek. Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be (n = 6 egér/csoport). b P

A magas koleszterinszintű (CH) diéták növelik a TLR2 expresszióját a makrofágokban, a TLR2 blokkolás pedig csökkenti a CH által kiváltott CHOP expressziót és az apoptózist az érelmeszesedéses elváltozásokban. (A) A Movat festés plakk morfológiát mutatott ki az ApoE -/- Tlr2 +/+ és az ApoE -/- Tlr2 -/- egerek brachiocephalikus artériáiban. A skálasávok 200 µm-t képviselnek. A TLR2 hiány jelentősen csökkentette az elváltozások átlagos területét (B) és a nekrotikus magméretet (C) (n = 8 egér/csoport). (D) A kettős immunfluoreszcencia a TLR2-t expresszáló makrofágok behatolását mutatta ki 12–24 hetes ApoE -/- egerek brachiocephalicus artériás elváltozásaiba, amelyek 6 hetes kortól kezdve aterogén étrendet kaptak. A méretarány 20 µm-t jelent. A jelzett életkorban az ApoE -/- Tlr2 -/- egerek CHOP (E), Bcl-2 (F) és szignifikánsan hasított kaszpáz-3 (G) expressziót mutattak ki az aortákban. Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be (n = 4-6 egér/csoport). b P -/- ugyanabban az életkorban. e P -/- 12 hetes chow étrend.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Vita

A gyulladásos folyamatok alapvető szerepet játszanak az érelmeszesedés kialakulásában. Kimutatták, hogy a TLR2 részt vesz ebben a folyamatban 11, 27. Az érelmeszesedés korai szakaszának korábbi tanulmányaival összhangban a TLR2 aktivitás blokkolása csökkentette a plakkok makrofág infiltrációját; a gyulladásos mediátorok, köztük az MMP-2, a TNF-a és az IL-6 expressziója; és az NF-KB 20, 21, 23 transzkripciós faktor inaktiválása. Továbbá a TLR2 antagonizmusa gátolta az IL-10 immunszuppresszív mediátorok és a Stat3 transzkripciós faktor expresszióját is, jelezve, hogy a TLR2 blokkolásának előnyei a gyulladás kiterjedt gátlásától függenek. Ez a tanulmány a TLR2 által kiváltott gyulladás első bizonyítékát nyújtja előrehaladott elváltozásokban, amelyek kiegészítik a TLR2 korábban feltárt járulékos szerepét a korai érelmeszesedésben.

A plakk instabilitása az előrehaladott érelmeszesedés fontos jellemzője. Bár a lepedék repedésének hátterében álló mechanizmusok továbbra is megfoghatatlanok, számos tényezőről kiderült, hogy hozzájárulnak ehhez a folyamathoz, beleértve a makrofágok felhalmozódását, a gyulladásgátló mediátorok magas szintjét, a túlzott MMP aktiválást, valamint a VSMC és makrofágok apoptózisát. A gyulladásos válaszok szabályozása mellett megfigyeltük, hogy a TLR2 blokkolás csökkentette a makrofág apoptózist TUNEL elemzéssel és immunfluoreszcenciával.

Összefoglalva, kimutattuk, hogy a TLR2 gén inaktiválása ApoE -/- egerekben a gyulladás és az apoptózis gátlásának eredményeként csökkentette a lepedék méretét és megnövelte a plakk stabilitását a brachiocephalicus artériában az előrehaladott ateroszklerózis során. Különösen ezen egerek kezelése TLR2-semlegesítő antitesttel kedvező terápiás hatást váltott ki, és ígéretes terápiás stratégiaként szolgálhat az előrehaladott érelmeszesedés ellen. Mivel a betegség megindításához a TLR2 fokozott expressziójára van szükség az endothel sejtekben, a TLR2 közvetítheti vagy felerősítheti az ER stressz által kiváltott apoptotikus jeleket előrehaladott ateroszklerotikus elváltozásokban. Munkánk azt sugallja, hogy a TLR2 jelátvitel farmakológiai blokkolása vonzó megközelítés az érelmeszesedés jövőbeli kezelésében.

Szerző hozzájárulás

Xiao-xing WANG és Zhuo-wei HU tervezte a vizsgálatot; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV és Hui-min YAN hozzájárult a módszertan kidolgozásához; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV, Jia-ping WANG, Hui-min YAN, Zi-yan WANG, Han-zhi LIU és Xiao-ming FU hajtották végre a kísérleteket; Xiao-xing WANG és Zhuo-wei HU elemezte az adatokat, és megírta az írást.