Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

Itt tanulmányozzuk a Cav hatását a Kv1-csatornák lipid-tutajának orientációjára egy lehetséges konzervált CBD-motívum funkciójának elemzésével a Shaker családban. A Kv1.3 és a Kv1.5 egyaránt megcélozza a lipid tutajokat, de csak a Kv1.3 hatékonyan lépett kölcsönhatásba Cavval a CBD-n keresztül, ahol ez az asszociáció elengedhetetlen a csatornák lokalizálásához ezeken a területeken. Ezenkívül a Kv1.3 viselkedését és aktivitását a Cav1 jelenléte szabta meg. Ezért a CBD jelenléte a Kv1.3 T1 közelében fontos funkcionális következményekkel jár a Kv1.3 csatorna fiziológiájára nézve.

Eredmények

A lipid tutajok Kv1.3 és Kv1.5 partíciójának differenciális caveolin-függése

caveolin

A jelzett csatornával (YFP-jelölt) történő transzfekció után 24 órával nyert HEK Cav1 teljes fehérje-lizátumokat immunprecipitáltuk kaveolin ellen. Az SDS-PAGE-vel elválasztott és a GFP (csatorna) és a caveolin antitestek ellen immunblotolt (IB) minták. ( NAK NEK ) A csonka Kv1.3 csatornák és a Kv1.3-Kv1.5 kimérák sematikus ábrái. Kv1.3 domének: fehér hordók és fekete vonalak. Kv1.5 domének: szürke hordók és szürke vonalak. ( B ) Kiindulási anyagok. A felső panelen a szűrőket immunblotoltuk a GFP (csatornák) ellen. Az alsó panelen a szűrőket Cav-tal tesztelték, hogy kimutassák a Cav-immuncsapódást. ( C ) Immunprecipitátok. Ellenanyag (IP-) hiányában nem tapasztaltunk immuncsapadékot.

Teljes méretű kép

A Caveolin 1 kölcsönhatásba lép a Kv1.3-tal a csatorna N terminálján elhelyezkedő CBD aláíráson keresztül

A HEK Cav- (bal oldali panelek) és a HEK Cav1 (jobb oldali panelek) Kv1.3CBD ( NAK NEK ) és mutáns Kv1.5CBD csatornák ( B ) (166 FQRQVWLLF 174 - AQRQVGLLA és 232 FQRQVWLIF 240 - AQRQVWLIF 240 - AQRQVWLIF 240). ( C ) A Kv1.3 vagy Kv1.3CBD-t expresszáló HEK Cav1-et caveolin (IP: Cav1) ellen immunprecipitáltuk caveolin antitest jelenlétében (+) és távollétében (-). A mintákat SDS-PAGE-vel elválasztottuk és Kv1.3 (IB: Kv1.3) és caveolin (IB: Caveolin) SM: kiindulási anyag ellen immunfoltot készítettünk; SN: felülúszó; PI: immunprecipitátum.

Teljes méretű kép

Nem találtunk kölcsönhatást a Kv1.5 és a Cav1 között; amikor azonban a feltételezett Kv1.5 CBD-t Kv1.3-ra (Kv1.5I239L) konvertáltuk, pozitív Cav1 koimmunoprecipitációt figyeltünk meg S4. Ezenkívül a bizonyítékok arra utalnak, hogy a Kv1.5 szupramolekuláris komplexek, köztük az SAP97 33, 34 közvetett kölcsönhatásba léphet a caveolinokkal. Az SAP97 (szinapszis-asszociált fehérje 97) a membránhoz kapcsolódó guanilát-kináz (MAGUK) család tagja, amely magában foglalja a PSD95-et is (Postsynaptic density protein 95). Ezért a Kv1.5-et expresszáljuk PSD95 jelenlétében és hiányában a HEK Cav1 sejtekben. Ebben a forgatókönyvben a Kv1.5 együtt immunimmunizálódott a Cav1-gyel, csak PSD95 jelenlétében (S4. Ábra). Ezért adataink azt sugallják, hogy míg a Kv1.3 CBD teljes integritása elegendő a Cav1-nel való kölcsönhatáshoz, a Kv1.5-hez szükség van segítő fehérjékre.

Vita

A bizonyítékok azt mutatják, hogy a Kv1.3 megcélozza a specifikus 35, 36 membránhelyzeteket és a helyváltozásoknak kóros következményei vannak 37. Vizsgálatunk kiemeli a Kv1.3 csatorna membránfelületének megoszlásának fő mechanizmusát. Itt számolunk be arról, hogy a Kv1 (Shaker) csatornák közül csak a Kv1.3 és a Kv1.5 szignifikánsan célozta meg a lipid tutajokat. Bár a Kv1.5 felhajtóereje független volt a caveolin expressziójától, a Kv1.3 lipid tutajok koncentrációja kaveolin dózisfüggő módon nőtt. Ennek fiziológiai jelentősége van, mert Cav1 -/- egerekből származó BMDM-ben igazolták. Ezenkívül a caveolin csatorna kolokalizációja magasabb volt Kv1.3-mal, mint Kv1.5-vel. Végül egyértelműen meghatároztuk azt a CBD-t, amely a Kv1.3 N-terminális doménjében található, és amely a Cav1 kölcsönhatásért és a csatorna lipid-tutajának helyéért felelős elem. Mivel a lipid tutajok orientációját javasolták ioncsatorna-szabályozás mechanizmusaként, eredményeink hozzájárulnak ehhez a terjeszkedő mezőhöz.

Összefoglalva, eredményeink segítenek tisztázni azokat a mechanizmusokat, amelyek a Kv1 csatornákat olyan speciális felületi mikrodoménekre irányítják, amelyek részt vesznek a sejtek válaszainak finomhangolásában. Más Kv1 idegsejtcsatornákkal ellentétben a Kv1.3 kölcsönhatásba lép a caveolinnal egy CBD-n keresztül, amely a csatorna N-terminális doménjében helyezkedik el, az első transzmembrán szegmens mellett, valamint a T1 domén és a Kvβ kötőhely közvetlen közelében. Ez az asszociáció a Kv1.3-at olyan csatorna struktúrákra irányítja, amelyek a csatorna membránjának dinamikáját és aktivitását egyaránt szabályozzák.

Mód

Expressziós plazmidok és helyspecifikus mutagenezis.

A patkány Kv1.3-at a pRcCMV-ben TC Holmes (Kaliforniai Egyetem, Irvine, Kalifornia) biztosította. A pGEM7 patkányban lévő Kv1.1 és Kv1.4, valamint a pBK konstrukciókban lévő humán Kv1.5 elemeket pEYFP-C1 és pECerulean-C1 (Clontech) szubklónoztuk. A Kv1.3/Kv1.5 kimérákat a pEYFP-rKv1.3 és a pEYFP-hKv1.5 csatornákban hoztuk létre úgy, hogy a BglII és EcoRI helyeket beépítettük a csatornák termináljának N és C tartományába. A mutánsokat a QuikChange helyhez irányított mutagenezis készletek (Stratagene) felhasználásával állítottuk elő. A LoopBAD szekvenciát (BAD, biotin akceptor domén) inszertáltuk a pEYFP-Kv1.3 első extracelluláris hurokjába az rKv1.3LoopBAD konstrukció egy már létező NruI helyén belül. A pBtac_BirA konstrukciót tartalmazó E. coli biotin ligázt alkalmaztuk az előzőekben leírtak szerint54. A pECerulean-C1 patkány Cav 1-et JR Martens (Floridai Egyetem Orvostudományi Kar) biztosította. A Cav1-et Cav-pECerulean (HindIII-BamHI) emésztésével inszertáltuk a pcDNS3-ba. A konstrukciókat szekvenálással igazoltuk.

Sejtkultúra, tranziens transzfekciók és tutajok izolálása.

A HEK 293 sejteket 10% FBS-t és 100 NE/ml penicillin/sztreptomicint (Gibco) tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük. Az átmeneti transzfekciót Metafectene ™ Pro-val (Biontex) végeztük majdnem 80% -os összefolyásnál. Az egér csontvelőjéből származó makrofágokat a korábban leírt módon izoláltuk [55]. Valamennyi kísérletet és műtéti protokollt a barcelonai egyetem etikai bizottsága által az Európai Közösség Tanácsának 86/609/EGK irányelvét követően jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtották végre.

Alacsony sűrűségű, Tritonban oldhatatlan komplexeket izoláltunk a 18., 20. leírás szerint. A sejteket 1 ml 1% Triton X-100-ban homogenizáltuk, és szacharózt adtunk hozzá 40% végkoncentrációig. 5-30% lineáris szacharózgradientust tettünk a tetejére, és további centrifugálással (39 000 fordulat/perc) 20-22 órán át 4 ° C-on Beckman SW41 rotorban. Gradiens frakciókat (1 ml) gyűjtöttünk a tetejéről, és Western-blot-analízissel elemeztük.

Fehérje extrakció, koimmunoprecipitáció és Western blot elemzés.

A hideg PBS-ben mosott sejteket jégen lizáltuk NHG-oldattal (1% Triton X-100, 10% glicerin, 50 mmol/l HEPES pH 7,2, 150 mmol/l NaCl) kiegészítve 1 μg/ml aprotininnel, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin és 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid a proteázok gátlására. A homogenizátumokat 16 000 x g sebességgel 15 percig centrifugáltuk, és a fehérjetartalmat Bio-Rad fehérje esszével mértük.

Az immuncsapáshoz a mintákat 30 µl Protein A-Sepharose gyöngyökkel 2 órán át 4 ° C-on előtisztítottuk, kíméletes keverés mellett, a társimmunoprecipitációs eljárások részeként. A gyöngyöket ezután centrifugálással eltávolítottuk 1000 xg-vel 30 másodpercig 4 ° C-on. A mintákat egy éjszakán át inkubáltuk anti-caveolin antitesttel (4 ng/ug fehérje) 4 ° C-on, enyhe rázással. Harminc mikroliter protein A-Sepharose-t adunk minden mintához, és 4 órán át 4 ° C-on inkubáljuk. A gyöngyöket 1000 x g-vel 30 másodpercig 4 ° C-on végzett centrifugálással eltávolítjuk, négyszer NHG-vel mossuk és 100 μl Laemmli-ben szuszpendáljuk. SDS puffer.

A fehérjemintákat (50 ug), a tutajfrakciókat (50 µl) és az immunprecipitátumokat Laemmli SDS töltőpufferjében forraljuk, és 10% SDS-PAGE-vel elválasztjuk. Ezután a mintákat PVDF membránokra (Immobilon-P, Millipore) vittük át, és 5% Tween 20 PBS-sel, 5% tejporral kiegészítve blokkoltuk. A szűrőket ezután specifikus antitestekkel immunblotolták: anti-GFP (1/1000, Roche), anti-caveolin (1/2, 500, BD Biosciences), anti-Kv1.3 (1/500, Neuromab), anti-clathrin (1/1000, BD Biosciences), anti-flotillin (1/1000, BD Biosciences). Végül a szűrőket 0,05% Tween 20 PBS-sel mostuk és torma-peroxidázzal konjugált szekunder antitestekkel (BioRad) inkubáltuk.

Immunocitokémia, plazma membrán gyep (PML) és transzmissziós elektron mikroszkópia.

A pol-D-lizinnel kezelt fedőlemezekre beoltott HEK-sejteket 24 órával a transzfekció után használtuk (Metafectene Pro). A sejteket PBS-ben (K + -mentes foszfátpufferolt sóoldat) mostuk, és 4% paraformaldehiddel rögzítettük 10 percig szobahőmérsékleten (szobahőmérsékleten). A Cav 1 kimutatásához a sejteket 0,1% Triton X-100 alkalmazásával 10 percig permeabilizáltuk. 60 percig blokkoló oldatban (10% kecskeszérum (Gibco), 5% zsírmentes száraz tej, PBS) a sejteket nyúl anti-caveolin antitesttel (1/100, BD Biosciences) kezeltük 10% kecskeszérumban. 0,05% Triton X-100 és ismét inkubáljuk 1 órán át. Három mosás után a készítményeket 45 percig inkubáltuk az Alexa-Fluor-555 konjugált antitesttel (1: 500; Molecular Probes), mostuk és Mowiol-ba (Calbiochem) szereltük fel. Minden eljárást RT-ben hajtottunk végre.

A PML-készítményeket ozmotikus sokk segítségével állítottuk elő kisebb módosításokkal 29. Röviden, a sejteket jégen hűtöttük 5 percig, és kétszer mostuk PBS-ben. A sejteket ezután 5 percig inkubáltuk 1/3 KHMgE-ben (70 mM KCl, 30 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 3 mM EGTA, pH 7,5), és óvatosan hígítatlan KHMgE-vel mossuk a hipotonikus sokk kiváltása érdekében. A törött sejteket fel és le pipettázással távolították el a fedőlapról. Két KHMgE pufferrel végzett mosás után csak a membránlemezeket tapadták meg. A PML-eket friss 4% -os paraformaldehiddel rögzítettük 10 percig szobahőmérsékleten, és Mowiol rögzítő közegbe helyeztük.

A transzmissziós elektronmikroszkópiához a PML-eket az immunocitokémiához hasonlóan kezeltük, de különböző szekunder antitestekkel vizualizáltuk. A Kv1.3-ot egy egér anti-Kv1.3 antitest ismerte fel (1/20, Neuromab). A 10 nm-es és 15 nm-es aranyrészecskékhez konjugált kecske anti-egér és anti-nyúl antitestek felismerték a Kv1.3-ot, illetve a Cav1-et. Röviden, a feldolgozott mintákat 2,5% glutáraldehiddel PBS-ben 30 percig szobahőmérsékleten rögzítettük. Ezután a mintákat liofilizáltuk, mostuk és 10% metanollal krioprotektáltuk. Ezután a mintákat kriogén gyorsfagyasztásnak vetettük alá (BAF-060, Bal-Tec) 90 percig -90 ° C-on és 10–7 mbar nyomáson. A replikákat forgatással (136 fordulat/perc) állítottuk elő, 1 nm-es platinát elpárologtatva egy elektronpisztollyal (23 ° -os szögben). Ezt 10 nm-es szén bepárlása (75 ° -os szögben) megerősítette. A replikákat 30% -os fluorsavval elválasztottuk a mintától. Végül a mintákat mostuk és Formvarral bevont állványokra szereltük fel.

Föster rezonancia energiaátadás (FRET)

A FRET-et az akceptor fényfehérítési konfigurációjában hajtották végre. A képeket Leica SP2 konfokális mikroszkóppal készítettük. A felvételeket az YFP fehérítő előtt és után készítettük, 63-szoros olajmerítési objektívvel a 4-es zoomon. A gerjesztést az Ar lézer 458 és 514 nm-es vonalain keresztül hajtottuk végre, és az emissziós szűrőket 473–495 és 535–583 sávszélességgel használtuk. A FRET hatékonyságot (FRETeff) az alábbi egyenlet segítségével számoltuk ki:

ahol, F D után: donor fluoreszkáló (Cerulean) után és F D az akceptor fehérítő előtt (YFP). Az elemzést ImageJ alkalmazásával hajtottuk végre.

Fluoreszcencia helyreállítás fotoelektromos fehérítés (FRAP) és egyedi részecskekövetés (SPT) után

A kísérleteket a korábban leírt 46, 54, 56 szerint végeztük. Az FRAP kísérletekhez Olympus FV1000 mikroszkópot használtak. Röviden: az YFP-t 250 ms-ig fehérítettük 30% -os, 515 nm-es Ar vonalú lézerrel, és a fluoreszcenciát fehérítés előtt és után PLAPO 60x NA 1: 1 olajos objektívvel, 40-es 40-es zoomolással, 108 másodpercenként felvett fehérítéssel figyeltük. Az akvizíciót 1% -os, 515 nm-es Ar lézervezetékkel és 525–560 nm-es sáváteresztő szűrővel végeztük.

Elektrofiziológia

Teljes cellás parch-clamp beállítási kísérleteket hajtottunk végre, ahogy azt a 49-ben tettük. A feszültségfüggő áramok előidézésére a cellákat 250 ms négyzet alakú impulzusokkal stimuláltuk -60 és +80 mV között, 10 mV lépésekben. A C típusú inaktiválást 5 másodperces hosszú impulzus alkalmazásával vizsgáltuk +60 mV mellett. A csúcsamplitúdót (pA) a kapacitásértékek (pF) alkalmazásával normalizáltuk. Az adatok elemzését a FitMaster (HEKA) és a Sigma Plot 10.0 (Systat Software) szoftverekkel végeztük. Minden felvétel RT-ben készült.