• Itt:
  • Rajt
  • Képzés modul nélkül
  • A genom szerkesztésében elért eredmények a CRISPR Cas 9 segítségével

A genom szerkesztésében elért eredmények a CRISPR Cas 9 segítségével

CRISPR: Fürtözött, rendszeresen interpace rövid rövidindulatú ismétlések, csoportosított és szabályosan elhelyezett rövid palindromikus ismétlések

szerkesztésében

A CRISPR-Cas rendszerek alkalmazásai az utóbbi években fejlődtek, mióta felfedezték baktériumokban való jelenlétüket. Azóta különböző területeken javasolják alkalmazását, például a mezőgazdaságban, a genetikailag megalapozott betegségek tanulmányozásában sejt- és állatmodellekben, erjesztett élelmiszerek előállításában, a baktériumok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájában és a lehetséges génterápiában.

1987: Yoshizumi Ishino felfedezi a palindromikus ismétlődő szekvenciák létét az Escherichia Coli DNS-ben.

1993: Francisco J. M. Mojica a halofil archaea baktériumok genomjának azon részének szekvenálásával, amely a Santa Pola-só lapátjait lakta, 30 bázispár palindrom szekvenciáját azonosítja egymástól, amelyeket 36 bázispár töredékei választanak el, az úgynevezett távtartók.

2000: A Francisco J. M. Mojica által vezetett csoport az adatbázisokban keresve nagyszámú ilyen ismételt szekvenciát talált baktériumokban, archeákban és mitokondriumokban, és javasolta a CRISPR nevet, amely jelentése: "Fürtözött és rendszeresen interspaced rövid palindromikus ismétlések".

2002: Holland mikrobiológusok egy csoportja olyan génkészletet ír le, amely kódolja a CRISPR szekvenciákkal (cas vagy CRISPR asszociált gének) összefüggő nukleázokat

2005: A CRISPR rendszerek távtartóinak egy része a vírusok és plazmidok DNS-forrásaiból származik. Francisco J. Mojica kutatócsoportja azt javasolja, hogy a kapcsolódó távtartók a baktériumok immunrendszerének részei lehessenek.

2008: John van der Oost azt mutatja, hogy az E-Scherichia coli baktériumban a fágból származó távtartókat átírják egy RNS-be, amelyet CRISPR RNS-nek (crRNS-eknek) neveznek, amely a vírus DNS-hez kötődik és a Cas fehérjéit irányítja a cél DNS-t kettős szálú vágás elvégzésére.

2009: A CRISPR-Cas9 kimutatta, hogy pontos pozíciókban kettős szálú DNS töréseket hoz létre, és megerősítést nyert az is, hogy a Cas9 az egyetlen fehérje, amely a hasításhoz szükséges a CRISPR-Cas9 rendszerben.

2011: Emmanuelle Charpentier az Umee Egyetemről egy kis RNS-szekvenálást végez Streptococcus pyogenes-ben, amely CRISPR-Cas9 rendszert tartalmaz, és felfedezi, hogy a crRNS mellett létezik egy második RNS is, amelyet CRISPR RNS transzaktivációnak (tracrRNS) hív. Ez azt is mutatja, hogy a tracrRNS a crRNS-szel együttműködve irányítja a Cas9-et a céljai felé.

2012: Emmanuelle Charpentier és Jennifer Doudna a Berkeley-i Kaliforniai Egyetemről bemutatják, hogyan lehet használni a CRISPR-t programozható szerkesztő eszközként, amely képes levágni a DNS bármely szálát in vitro.

2013: Feng Zhang kutató sikeresen adaptálja a CRISPR-Cas9 rendszert az eukarióta sejtekben történő genomszerkesztéshez két különböző Cas9 ortológ gén megtervezésével és specifikus genom hasítás bemutatásával emberi és egér sejtekben.

A baktériumok genomja két kör alakú DNS-láncból áll, ezek a láncok kiegészítik egymást. Amikor elolvassuk a körülbelül 4 vagy 5 millió betűs genomot, megismétlődések sorozatát látjuk, amelyek a genomban többször megismétlődnek, és egymástól el vannak választva. Ezen ismétlődő egységek mindegyikét CRISPR-nek hívják, amelyek "Rendszeresen csoportosított, rövid palindrómás ismétlések". Minden ismétlés után bakteriofág vírus DNS-ből származó távtartó DNS rövid szakaszait találjuk. Nagyon közel ezekhez az ismétlésekhez találhatók azok a cas gének, amelyek egy olyan nukleázfehérjét kódolnak, amelyek a CRISPR aktivitás végrehajtói.

A baktériumokat, csakúgy, mint az embereket, vírusok fertőzik meg, amelyek a membránjukon található specifikus receptorok révén ismerik fel a baktériumokat. A vírus be fogja vezetni genetikai anyagát a baktériumok belsejébe, és a baktériumok saját gépe segítségével több ezer vírusrészecskét állít elő, amelyek megtörik a baktériumok burkolatát, és a környezetbe kerülve másokat megfertőznek. Azok a baktériumok, amelyek túlélik a vírus támadását, megőrzik a DNS egy töredékét a vírustól, és távtartóként beépítik a CRISPR-Cas rendszerbe, és generációról generációra megőrzik azt. Ezeket a távtartókat átírják az úgynevezett "CRIPR RNS" (crRNS-ek) nevű RNS-be, amelyek útmutatóként szolgálnak a Cas fehérje számára, és amelyek ugyanazon vírus második fertőzése esetén kötődnek a behatoló vírus DNS-éhez.

Amikor ugyanaz a vírus újrafertõzi a baktériumokat, a vírus távtartójának megfelelõ crRNS komplementaritással csatlakozik a vírus DNS kettõs szálához. Miután a transzaktivációs RNS (tracrRNS) segítségével csatlakozott a DNS kettős szálához, ők vezetik a Cas 9 fehérjét, amely egy endonukleáz, amely a vírus DNS kettős szálának vágását hozza létre, megakadályozva ezzel a fertőzést. Ezért a CRISPR-Cas rendszert szerzett immunrendszernek tekintik a különböző organizmusokban.

2012-ben Emmanuelle Charpentier és Jennifer Doudna tudósok bemutatták, hogyan lehet a CRISPR-t programozható szerkesztőeszközként használni, amely felhasználható bármely DNS kettős szál vágására in vitro. Ily módon lehetőség van arra, hogy a rendszert úgy programozzuk, hogy bármely DNS meghatározott helyzetébe kerüljön, és kivágja, ehhez a legegyszerűbb CRISPR rendszert használják, amely a Cas 9 nevű fehérjére épül. Bebizonyították, hogy az információkkal megérte a Cas9-ből és egy vezető RNS-ből, amely rendelkezik a kivágni kívánt fragmens komplementer szekvenciájával, ezt összekeveri azzal a fragmenssel, amelyben vágást kíván létrehozni, és a Cas 9 fehérje oda fog menni, ahova az irányadó RNS irányítja, és elvágja abban a helyzetben, amelyet jelez.

A Cas 9 fehérje kettős szálú vágást végez, molekuláris ollóként működik a DNS-en. A CRISPR rendszer képes megcélozni egy adott szekvenciát. A 20 ribonukleotidból (crRNS) álló RNS-molekula, a DNS-lánc 20 nukleotidjával és a Cas9 fehérjével egy nagy specifitású restrikciós enzim, amely egy adott helyen előállítja a vágást.

Ha a DNS kettős szála elvágódik, a fizikai folytonosság megszakad és az információ elvész a következő osztódási körben a következő sejtciklusokban, ezért a sejtnek két DNS-javító mechanizmusa van.

Két javítási mechanizmus létezik:

Nem homológ célok egyesülése:

Ezt a vágást detektálják, és véletlenszerűen, cipzáras hatással kezd lebontani és hozzáadni a nukleotidokat. Valószínűleg az eredeti szerkezet megváltozik, és a nukleotidok inszertálódnak vagy törlődnek, így az úgynevezett "Indels" -nk lenne, és génhiba lép fel. Ez a gén nem fog működni. Elég egy mutáns előállítása, amely a DNS egy meghatározott területén vágódik le. Ez abban az esetben érdekel minket, ha el akarjuk veszíteni egy gén funkcionalitását.

Homológ közvetlen javítás:

Ha a rendszernek olyan szekvenciát adunk, amely homológ a vágással szomszédos területekkel és új szekvenciákat tartalmaz, akkor ezek a szekvenciák integrálódnak, mivel a cella sablonként fogja használni. Ha javítania kell, megpróbálja követni ezt a sablont, és bevezeti azokat a szekvenciákat, amelyek korábban nem voltak, vagy mutációt lehet beiktatni, vagy eltávolítani a mutációt, és helyreállítani a helyes szekvenciát. A CRIPSR csak vágja a DNS-t, de elindítja a javítási folyamatot.

A javítás e két formája lehetővé teszi számunkra, hogy tanulmányozzuk egy gén funkcionalitását, tanulmányozzunk egy genetikailag megalapozott betegséget, amelynek mutációja, inszerciója vagy szubsztitúciója van.

Genom szerkesztése

Szükséges elemek

Először megvan a kettős szálú DNS célszekvenciája, amelyet el akarunk vágni. Lesz egy útmutató RNSünk, amelyet a célszekvenciához kötődő RNS alkot, és egy olyan transzaktivációs RNS-t, amely jelzi a Cas 9 fehérjéhez, hogy hol kell elhelyezni a vágás elvégzéséhez. És végül a Cas 9 fehérje, amely az endonukleáz, amely elvégzi a vágást-

A genomszerkesztés megkönnyítése érdekében egy irányító RNS-t (gRNS) terveztek, amely egy kiméra RNS volt, amely a crRNS és a tracrRNS összes lényeges összetevőjét tartalmazta. Több CRISPR/Cas9 variánst fejlesztettek ki, felismerve 20 vagy 24 nt szekvenciát, amelyek megfelelnek a tervezett gRNS szekvenciáknak és 2-4 nt PAM szekvenciáknak a célhelyeken. Ezért a CRISPR/Cas9 elméletileg megcélozhat egy specifikus, 22–29 nt DNS-szekvenciát, amely egyedülálló a legtöbb genomban. A legújabb vizsgálatok azonban azt találták, hogy a CRISPR/Cas9 nagy toleranciát mutatott a bázispárok eltéréseivel szemben a gRNS és komplementer célszekvenciája között.

A CRISPR rendszer különböző funkciói

CRISPR-Cas9 alkalmazások

Fermentált termékek előállítása a baktériumkultúrák vírusokkal történő szennyeződésének megakadályozása érdekében.

A baktériumok tipizálása a bennük levő távtartók szerint végezhető el.

Antibiotikum rezisztencia

Szelektív antimikrobiális tervezés.

Készítsen genetikai alapú betegségek sejt- vagy állatmodelljeit

Hajtsa végre az epigenetikai módosításokat

A szélsőséges körülményeknek ellenálló növények

Lassú gyümölcsérés

Nagyobb izomtömegű szarvasmarhák

Biztonságos állatszervek az emberi transzplantációhoz

Gyógyítani/megelőzni a betegségeket. Vírusok: HIV, herpesz, hepatitis B, mononukleózis. fertőző.

Maláriarezisztens szúnyogok

Szomatikus génterápia

CAR-T kezelések.

CRISPR korlátozások:

Nem cél: A vágások nem a kívánt célszekvenciában fordulhatnak elő.

Immunogenitás: A CRISPR-Cas rendszerek baktériumokból származnak és immunválaszt válthatnak ki, ha az adott mikroorganizmus korábban fertőzésnek volt kitéve. Pl .: Streptococcus Pyogenes.

Túlélés genetikailag megváltozott sejtek.

Nem tudjuk ellenőrizni a hatékonyság homológ javításban (HDR).

Hatékonyság, szövetspecifitás és transzfer hatékonyság.

Mozaikok: A változások nem minden cellában fordulnak elő.