Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

Eredmények

A Gas2/HSP90/HSP40 kaszpáz-3 rokon fehérjekomplexet képzett a rizsszuszpenziós sejtekben hőterhelés alatt

amely

( nak nek ) A G-75 oszlopból származó aktív kaszpáz-3 frakciókat egyesítettük és tovább tisztítottuk egy Mono-Q oszlopon, amelyet 20 mM Tris/HCl pufferrel (pH 8,0) egyensúlyoztunk ki. A fehérjéket NaCl gradienssel eluáltuk (0

1 M) 20 mM Tris/HCl pufferben, pH 8,0, 1 ml/perc áramlási sebességgel. A fehérjéket abszorbanciával detektáltuk 280 nm-en. A csúcsokat összegyűjtöttük. ( b ) A Mono-Q oszlopból összegyűjtött azonos számú csúcsokat Ac-DEVD-AMC-vel inkubáltuk. Az AMC fluoreszcenciát mikrolemez-olvasóval mértük 30 ° C-on. Az RFU/óra a relatív fluoreszcencia egységnyi különbségeket képviselte, amelyek 1 óra alatt keletkeztek. Az I és II a kaszpáz-3-szerű aktivitást mutató csúcsokat jelöli.

Teljes méretű kép

Teljes méretű asztal

A Gas2 expressziós profilja különböző feszültségek mellett.

Fiziológiai körülmények között a Gas2 a glükozidáz II nem katalitikus alegysége, amely részt vesz a fehérjék glikozilezésében az ER-ben. A Gas2 abiotikus stressz alatti biológiai funkcióinak azonosítása érdekében a Gas2 expresszióját valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakcióval mértük különböző körülmények között, még DTT által kiváltott ER stressz alatt is. A 6,4 mM DTT-vel történő kezelés az UPR marker génje, az Os bZIP50 34 expresszióját indukálta, ami azt jelezte, hogy a DTT képes ER stresszt indukálni a rizsszuszpenzió sejtjeiben (2a. Ábra), és ilyen körülmények között a Gas2 szabályozva volt ( 2b. Ábra). Az ER stressz mellett a Gas2 szintjét különböző abiotikus stresszek, például hideg stressz (2c. Ábra), ozmotikus (2d. Ábra) és só (2e. Ábra) alatt is szabályozták.

( nak nek ) A DTT vad típusú és OsGas2 RNSi sejtvonalakban indukálta az OsbZIP50 expresszióját. Protoplasztokat állítottunk elő szuszpenzióban lévő sejtekből, és 6,4 mM DTT-vel kezeltük 18 órán át 26-28 ° C-on ( b ) OsGAS2 expresszió szuszpenziós sejtproplasztokban, 6,4 mM DTT kezeléssel, különböző időpontokban. ( c - e ) Az OsGAS2 kifejeződése 8 napos palánták gyökerében 4 ° C-os kezeléssel ( c ), 150 mM NaCl ( d ) és a PEG 6000 40% -át ( és ) különböző időkben. Az RT-PCR-hez teljes RNS-t izoláltunk, és a kísérleteket háromszor megismételtük.

Teljes méretű kép

Szubcelluláris hely

Mivel a Gas2 kaszpáz-3 rokon fehérje komplexet képez a TPR-t tartalmazó GRP94-szel és HSP40-gyel, megvizsgáltuk e három fehérje szubcelluláris lokalizációját. A várakozásoknak megfelelően a Gas2 és a GRP94 az ER-ben (3a. Ábra, b), míg a TPR-t tartalmazó HSP40 a citoplazmában volt elhelyezve (3c. Ábra). Mivel a kaszpáz-3-szerű aktivitás jelen volt a citoplazmában, ez arra utal, hogy specifikus stressz körülmények között a TPR-tartalmú HSP40 komplexet képezhet a Gas2-vel és a GRP94-gyel az ER-citoplazma határfelületén, mivel ismert, hogy az ER kötési helyeket biztosít sok citoszol fehérje.

A 35S: Grp94-GFP, 35S: GAS2-GFP és 35S: GFA2-GFP termékeket PEG-kalcium által közvetített transzformációval a rizspalánták szárából protoplasztokba juttattuk. A GFP fluoreszcenciáját 16 órás inkubálás után figyeltük meg PerkinElmer UltraVIEW VoX konfokális mikroszkóppal. ER-Tracker ™ kék-fehér DPX-t (E12353) használtunk ER lokalizációs kontrollként. A kísérleteket legalább ötször megismételtük. Bar = 5 μm.

Teljes méretű kép

A Gas2-indukálta autofágia downregulációja rizsszuszpenziós sejtekben

Teljes méretű kép

A Gas2 a rizs kaszpáz-3-szerű aktivitásának új szubsztrátja.

( nak nek ) Címkéjét fuzionáltuk az OsGAS2 N-terminálisába és a D110A/D113A mutánsba, és a fúziós fehérjét E. coliban expresszáltuk. A megtisztított vad típusú és az Ő 6-jelölt mutáns fehérjéit hőkezelt rizsszuszpenziós sejtek reakciópufferével, kaszpáz-3-mal és citozolos frakciójával inkubáltuk. Inkubálás után a reakciótermékeket 12,5% SDS-PAGE-val elemeztük, majd immunoblot-tást végeztünk anti-poli hisztidin antitesttel, amely felismerte a His 6-tagjelölt OsGAS2 N-terminális epitópot. A nyilak a célfehérje sávokat jelzik. ( b ) Az OsGas2 kaszpáz-3 fragmentációjának sémája. A teljes hosszúságú, 74 KDa MW-os OSGas2-et lineáris molekulaként egy feltételezett DEPD 113 kaszpáz-3 hasítási hellyel szemléltetjük, amelyet nyíllal jelölünk. A kaszpáz-3 emésztés eredményeként egy N-terminális fragmens, amelynek MW-ja 14 KDa (N), és egy C-terminális fragmens, amelynek MW-ja 60 KDa ( C ).

Teljes méretű kép

A gas2 hasított terméke amplifikálta a kaszpáz-3-szerű aktivitást rizs protoplasztokban

A Gas2 hasítási termékek lehetséges funkciójának azonosításához a Gas2 N és C fragmenseket rizs mezofill protoplasztokban fejeztük ki Dex által indukált feltételes expressziós vektor alkalmazásával, és a Dex hatásosan indukálta fragmens expressziót (6a. Ábra). Az N fragmentum expressziójához és a vektorkontrollhoz képest a C fragmentum expressziója a kaszpáz-3-szerű aktivitás jelentős növekedését eredményezte hőkezelés után (6b. Ábra). Érdekes, hogy a két fragmenst expresszáló protoplasztokban DTT-kezelést követően nem találtunk autofagosómákat (az adatokat nem mutatjuk be).

( nak nek ) Az N-terminális fragmens (N) és a C-terminális fragmens (C) RT-PCR elemzése mezofil protoplasztokban. Teljes RNS-t készítettünk protoplasztokból Dex-kezeléssel vagy anélkül (kontroll) 18 órán át. 17S RNS-t használtunk terhelés kontrollként. ( b ) Kaspáz-3-szerű aktivitás mezofil protoplasztokban az N-terminális fragmens (N) és a C-terminális fragmens (C) expressziója alatt. Az N és C expresszióját Dex indukálta 18 órán át, majd a protoplasztokat 48 ° C-on 15 percig kezeltük, és 6 órán át hagytuk helyreállni 28 ° C-on. Az üres feltételes expressziós vektort tartalmazó protoplasztot használtuk kontrollként. Egyforma mennyiségű citoszolos frakciót inkubáltunk Ac-DEVD-AMC-vel, és az AMC fluoreszcenciát 60 perc alatt mértük mikroprocesszorral 30 ° C-on. RFU/mg: relatív fluoreszcencia egységek 1 mg fehérje.

Teljes méretű kép

Vita

⊥: az ebben a dokumentumban bemutatott gátlás útja; folytonos nyíl: aktivációs, transzlokációs vagy lebomlási útvonal, amelyet ebben a dokumentumban bemutattunk; tábla nyíl: az az út, amelyet ebben a dokumentumban nem vizsgáltak; körkör: a feltételezett kaszpáz-3-szerű enzim. A részletekért lásd a szöveget.

Teljes méretű kép

Mód

Növényi anyagok és kezelések.

Oryza sativa L. cv. A Nipponbare palántákat folyékony MS táptalajban növesztettük 25 ° C-on, 16 órás fény/8 óra sötét ciklus alkalmazásával. A stressz kezelésére a 8 napos csemetéket 4 ° C-on inkubáltuk lemezeken vagy MS folyékony táptalajban, amelyek 150 mM NaCl-ot vagy 40% PEG-6000-et tartalmaztak, különböző ideig. A DTT által kiváltott ER stresszhez 32 sejtszuszpenzió protoplasztjait 6,4 mM DTT-t tartalmazó folyékony MS táptalajjal 18 órán át 26-28 ° C-on inkubáltuk, majd kétszer MS-közeggel mostuk. Egyenlő térfogat vizet adtunk a tápközeghez DTT nélkül negatív kontrollként 41 .

A kaszpáz-3 típusú aktivitással kapcsolatos fehérjék tisztítása és azonosítása

Protoplast készítmény

A GAS2 és a vad típusú RNSi vonalak rizsszuszpenziós sejtjeit rutinszerűen szaporítottuk és tenyésztettük 28 ° C-on. A protoplasztokat 3-4 sejtből szuszpenzióban izolálták Maas és mtsai. 42. A protoplasztok zöld szövetből történő izolálásához a rizspalántákat tápoldatban 28 ° C-on 7-10 napig növesztettük. 10 cm magas palántákat használtunk protoplaszt izoláláshoz Wang és mtsai. 43 .

RNS kivonás rizspalántákból

A teljes RNS-t rizs protoplasztokból vagy palántagyökerekből izoláltuk Trizol reagenssel (Takara, Japán). A teljes RNS-t (5 μg) használtuk a cDNS-szintézishez a PrimeScript ™ RT reagenskészlettel gDNS Eraser-rel (Takara, Japán) a gyártó utasításainak megfelelően.

A reverz transzkripciós polimeráz láncreakció valós idejű kvantitatív elemzése

A valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakciót CFX 96 fluoreszcens kvantitatív PCR készülékkel hajtottuk végre (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Génspecifikus primereket alkalmaztunk az OsGAS2 transzkriptumok kimutatására, és 17S rRNS-t használtunk belső kontrollként. Mindegyik mintát három független kísérletben futtattuk, és a primer szekvenciákat az alábbiakban részletezzük.

OsGAS2 -F: TTGGTAAGGAGAAGGAGTTC; OsGAS2 -R: AGGCTGGTGGTACTATGT.

17sRNS -F: ACACGGGGGAAACTTACCAGGTC; 17sRNS -R: CCAGAACATCTAAGGGCATCAC.

Az RNAi-OsGAS2 sejtvonal építése.

Az RNAi-OsGAS2 előállításához az Ri 1-F/Ri 1-R primereket terveztük az OsGAS2 1. fragmenséhez, az Ri 2-F/Ri 2-R primereket pedig az OsGAS2 2. fragmenséhez (Kpn I/Sac I helyek és Mlu I/A BamH I helyek dőlt betűvel vannak feltüntetve:

Ri 1-F: GG GGTACC GCTGAGCATGATATGCCAGAAC; Ri 1-R: C GAGCTC TCCTTCCGAACACGAGAAGC.

Ri 2-F: CG ACGCGT TCCTTCCGAACACGAGAAGC; Ri 1-R: CG GGATCC GCTGAGCATGATATGCCAGAAC.

A $ config [ads_text16] nem található

Az 1. és 2. amplifikált fragmenst kétszer emésztettük KpnI/SacI, illetve MluI/BamHl alkalmazásával, majd az LH-FAD2-1390 RNSi vektorba klónoztuk. A rekombináns plazmidokat rizsszuszpenziós sejtekké alakítottuk át Agrobacterium fertőzéssel .

Az OsGAS2, OsGrp94 és HSP40 fehérjék szubcelluláris lokalizációja a rizs mezofil protoplasztokban

A szubcelluláris lokalizációs vizsgálathoz a teljes hosszúságú OsGAS2 (Os01g0276800), OSGrp94 (Os06g0716700) és feltételezett HSP40 (Os02g0100300) cDNS-t génspecifikus primerek segítségével amplifikáltuk (a BamH I helyet és a Kpn I dőlt betűvel mutatjuk be):

OsGAS2: F-CG GGATCC ATGGGGCTCCACGCGATCC; R-GG GGTACC GCGAGTTCATCATGGTCACGCT.

OsGrp94: F-CG GGATCC ATGCGCAAGTGGGCGCTCTCC; R-GG GGTACC CTACAGCTCGTCCTTATCATA.

HSP40: F-CG GGATCC ATGGATGCTTCTCGCGTTGGC; R-GG GGTACC TTACTGGGACCCATTGAATTT.

A PCR termékeket szekvenálással igazoltuk, majd gélt tisztítottunk az AxyPrep DNS gél kivonó készlettel (Axygen, Kína). A termékeket ezután BamH I-gyel és Kpn I-gyel emésztettük, és a pXZP008 44 szubcelluláris lokalizációs vektorba klónoztuk. A zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) kódoló riporter gént fuzionálták az OsGAS2-vel, az OsGrp94-gyel és az OsHSP40-gyel, amelyet a karfiol mozaik vírus 35S promotere (35S: OsGAS2/OsGrp94/OsHSP40-GFP) hajtott, majd átalakult és átmenetileg mezofilben expresszálódott. rizs. protoplasztok. 16 órán át, 26 ° C-on sötétben végzett inkubálás után a transzformált protoplasztokat 30 percig sötétben 28 ° C-on ER-Tracker ™ Blue-White DPX 100 nM-rel (E12353, Molecular Probes, USA) festettük és kétszer mostuk. W5 oldattal. A fluoreszcenciát PerkinElmer UltraVIEW VoX konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá. Az ER-t kontrollként az E12353 alkalmazásával azonosítottuk.

Rekombináns A és D típusú expresszió és tisztítás 110 A/D 113 A kettős mutáns OsGAS2 fehérje.

A rekombináns OsGAS2 Eschericia coli-ban történő expresszálása érdekében a teljes hosszúságú OsGAS2 cDNS-t (Os01g0276800, WT) és a D 110 A/D 113 A mutánst (Mu) génspecifikus primerekkel (az Nde I és az EcoR I helyeken mutatjuk be) amplifikáltuk. dőlt betű):

WT: F-GGAATTC CATATG GCCTCCAGGCCGCCGCTCGA;

WT: RG GAATTC TTAGAGTTCAYCATGGTCACG;

D 113 A: F- ACGGGAGTGATGAGTATGCTAGCAATGTCACTTGCAAG

D 113 A: R- CTTGCAAGTGACATTGCTAGCATACTCATCACTCCCGT

D 110 A/D 113: F- TTGCTGCGACGGGAGTGCTGAGTATGCTAGCAATGTC

D 110/D 113 A: R- GACATTGCTAGCATACTCAGCACTCCCGTCGCAGCAA

A szekvenálással igazolt PCR termékeket géltisztítottuk és kétszer emésztettük NdeI/EcoRl-gyel, klónoztuk a His-jelzett pET-28a-ba, majd E. coli DE3-ba transzformáltuk. Az expressziót 0,3 mM izopropil-bD-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) alkalmazásával indukáltuk 37 ° C-on 4 órán át. A sejteket összegyűjtöttük, és újra szuszpendáltuk lízispufferben (50 mM NaH2P04 (pH 8,0), 300 mM NaCl). Ultrahangos megszakítás után az elegyet 10 000xg-n 1 órán át 4 ° C-on centrifugáljuk. A kapott felülúszót Ni-NTA gyanta oszlopra (GenScript, Kína) töltjük. Az oszlop mosása után a His-jelzett OsGAS2-t eluáló pufferrel (50 mM NaH 2P04 (pH 8,0), 300 mM NaCl és 250 mM imidazol) eluáljuk).

OsGAS2 lebomlás kaszpáz-3-szerű aktivitással in vitro

A tisztított OsGAS2-His 6 fehérjét (100 μg) inkubáltuk kaszpáz-3-mal vagy hőkezelt rizsszuszpenziós sejtek teljes sejt-lizátumával 5 órán át 37 ° C-on vizsgálati pufferben (50 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 10% glicerin, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2 és 1 mM DTT). Az emésztett termékeket SDS-PAGE-vel elválasztottuk és Western-blot-módszerrel detektáltuk monoklonális egér anti-poli hisztidin antitest (1: 1000 hígítás, BOSTER, Kína) segítségével.

Az OsGAS2 fragmensek feltételes expressziója rizs mezofill protoplasztokban

OsGAS2 fragmensek: Az N- és C-fragmenseket génspecifikus primerek segítségével amplifikáltuk (az Xho I és Spe I helyeket dőlt betűvel tüntettük fel):

A termékeket kétszer emésztettük XhoI/SpeI-gyel, majd irányban klónoztuk a dexametazon (Dex) -indukálható pTA7002 bináris vektorba. Az így kapott konstrukciókat és a vektorkontrollt (20-25 μg) rizs-mezofill protoplasztokká alakítottuk.

Caspase-3-szerű aktivitásvizsgálat

A pTA7002 vektor kontrollal vagy a pTA7002-N/C-vel transzformált protoplasztokat W5 táptalajban szuszpendáltuk (kiegészítve 10 mM Dex-szel), és hat lyukú tenyésztőlemezen inkubáltuk 28 ° C-on, sötétben, meghatározott ideig. Inkubálás után a protoplasztokat 48 ° C-on 15 percig kezeltük, és 6 órán át 28 ° C-on hagytuk helyreállni. A protoplasztokat lízispufferben (50 mM HEPES (pH 7,4), 100 mM NaCl, 250 mM szacharóz, 0,1% CHAPS, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 1 mg/ml pepstatinin, 8 mg/ml aprotinin, 10 mg) szuszpendáltuk./ml leupeptin). A szuszpenziókat jégen homogenizáltuk, és 12 000 x g-n 5 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, az oldható citoszolos frakciókat összegyűjtöttük és vizsgálati pufferben (50 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 10% glicerin, 50 mM) inkubáltuk. KCl, 2,5 mM MgCl2 és 1 mM DTT) 70 mM N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metil-kumarinnal kiegészítve (Ac-DEVD-AMC, EnzoLife Sciences, USA). A reakciórendszert fény nélkül inkubáltuk 30 ° C-on 1 órán át. A fluoreszcenciát mikrolemez-olvasóban (TECAN, USA) mértük 380/460 nm-en. Az inkubálás előtti és utáni fluoreszcencia különbséget a megfelelő fehérjekoncentrációval normalizáltuk. Az összes vizsgálatot három független minta felhasználásával hajtottuk végre.

Elektron mikroszkóp

A DTT-vel kezelt protoplasztokat 2,5% (w/v) glutáraldehiddel fixáltuk CPW-9M-ben (pH 5,8) 4 ° C-on, egy éjszakán át, majd 1% (w/v) ozmium-tetroxiddal 3 órán át szobahőmérsékleten rögzítettük. Miután 1% (w/v) uranil-acetáttal szobahőmérsékleten 2 órán át festettük, a protoplasztokat etanol, víz és propilén-oxid többféle keverékével dehidratáltuk, majd Spurr gyantájába ágyazottuk. Szakaszok mérése

70 nm vastagságú darabokat vágtunk és festettünk uranil-acetáttal és ólom-nitráttal. A metszetmintákat elektronmikroszkóppal (H-7650, Hitachi) figyeltük meg.

A citoszolos Ca 2+ tartalom mérése

A Ca 2+ -érzékeny fluoreszcens festéket, a Fluo-3-AM-t használtuk a Ca 2+ -függő fluoreszcencia relatív változásának kimutatására protoplasztokban. A protoplasztokat 5 μM előmelegített Fluo-3-AM-mel (Dojindo Laboratories, Japán) inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on, a gyártó utasításainak megfelelően. Ezután a sejteket kétszer mostuk és újraszuszpendáltuk 0,4 M mannit tartalmazó HBSS-oldatban. A Fluo-3 fluoreszcenciát PerkinElmer UltraVIEW VoX konfokális mikroszkóppal mértük, gerjesztési és emissziós hullámhosszakat használva 488, illetve 525 nm-en. A protoplasztok fluoreszcencia intenzitását az egyes protoplasztok elhatárolásával mértük, a protoplasztok átlagos fluoreszcenciáját mértük és elemeztük az Image Pro Plus alkalmazásával. Minden kezeléshez 8-10 protoplasztot alkalmaztunk.

LSD-k címkézése

A DTT-vel és/vagy 3-MA-val kezelt protoplasztokat összegyűjtöttük, és 50 nM LysoTracker Red DND-99-vel (Molecular Probes, USA) inkubáltuk 20 percig 37 ° C-on, háromszor CPW-9M pufferrel mostuk, majd egy PerkinElmer Ultra VIEW VoX konfokális mikroszkóp. A gerjesztés hullámhossza 561 nm volt, az emissziós jeleket 590 nm-en mértük.

Hozzászólások

Megjegyzés benyújtásával vállalja, hogy betartja a Közösségi Feltételeinket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.