étrend

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • A kifejezés kifejezése gbb utánozza a HFD fenotípusokat Drosophila
  • A Gbb jelátvitel gátlása megmenti a HFD által kiváltott elhízást és a diabéteszes fenotípusokat
  • apróságok a Gbb jelzés egy downstream célpontja
  • apróságok negatívan szabályozza az inzulin jelátvitelt
  • a gátlása apróságok elnyomja az elhízás okozta gbb és a diabéteszes fenotípus
  • Vita
  • Anyagok és metódusok
  • Drosophila melanogaster készletek
  • Sejtkultúra, stimuláció és transzfekció.
  • HFD és teljesítmény
  • A test TG szintjének mérése
  • Trehalóz/glükóz szint mérése hemolimfában
  • RNS tisztítás és kvantitatív RT-PCR elemzés
  • Kultúra ex vivo kövér felnőtt testek
  • Western blot és immunfestés
  • Forgács
  • Luciferáz riportervizsgálat sejtekben Drosophila S2
  • statisztikai elemzés
  • további információ
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő információk
  • Hozzászólások

Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

A HFD-vel táplált legyek rendellenes glükóz- és lipidszintet és inzulinrezisztenciát mutattak, hasonlóan az elhízott emlősökhöz. A HFD által kiváltott inzulinrezisztenciát a Gbb törzsi út aktivitása közvetítette a zsír testben. Ezért a Gbb törzsi szignálozás célzott gátlása új terápiás stratégiát jelent az elhízás és a kapcsolódó anyagcsere-betegségek kezelésében.

Eredmények

A gbb expresszió indukálása utánozza a HFD fenotípusokat Drosophilában

A HFD 14. napján megmértük a TGF-β szupercsalád hét ligandumának expressziós szintjét a kifejlett légy zsírtartalmában. A tesztelt tényezők közül csak a gbb-expresszió növekedett szignifikánsan a HFD-táplálással (1A. Ábra), különösen a zsír testben (S2A. Ábra). Ezután megvizsgáltuk, hogy a gbb megváltoztathatja-e a zsír testében a TG és a hemolimfa trehalóz/glükóz szintjét. A gbb túlzott mértékű expressziója a felnőtt zsír testben (DCG> gbb) növelte a TG és a trehalóz/glükóz szintjét a kontrolllegyekéhez (DCG-Gal4/+) képest (1B. Ábra). A gbb túlzott expressziója azonban a belekben (NP3084> gbb) vagy az izmokban (MHC> gbb) nem változtatta meg a TG szintjét (S2B ábra). Továbbá a pAKT szintje szignifikánsan csökkent a zsírból származó gbb-ben (DCG> gbb), a bélben vagy az izomban levő gbb-ben azonban nem (S2C ábra).

A gbb túlzott expressziója a felnőtt zsír testben (pS106 GS> gbb + RU) jelentősen megnövelte a Dilp2 expresszióját, és kissé megnövelte a Dilp3 és a Dilp5 expresszióját a -RU kontrollok szintjéhez viszonyítva (1E ábra). Annak eldöntésére, hogy a gbb szabályozza-e az inzulin jelátvitelt, a legyek pS106 GS> gbb + RU vagy -RU kifejlett zsírtartalmát boncoltuk fel, és ex vivo inzulinnal kezeltük őket (S2E ábra). Az -RU kontrollokban az ex vivo inzulinkezelés növelte a pAKT szintjét a kezeletlen mintákhoz viszonyítva. Éppen ellenkezőleg, a legyekből + RU-ból nyert mintákban, amelyek túlzottan expresszálták a gbb-t a felnőtt zsír testben, az ex vivo inzulinkezelés nem növelte a pAKT szintjét (1F. Ábra).

Az inzulinszignalizáció gbb által történő szabályozásának további vizsgálatához megvizsgáltuk a dFOXO szubcelluláris lokalizációját lárva zsírtestekben, a specifikus zsírtest-kontroller DCG-Gal4 alkalmazásával. Ezekben a kísérletekben a boncolt zsírtesteket szérumtól megfosztották és ex vivo humán inzulinnal kezelték. A DCG-Gal4 éhezési kontrollban és a DCG> gbb zsírtestekben a dFOXO főleg a magokban lokalizálódott (1G. Ábra, I. ábra). Az inzulinstimuláció után a dFOXO fehérje majdnem az egészet a citoplazmában helyezte át a kontroll zsírtestekben, a DCG-Gal4 (1H ábra), míg a DCG> gbb zsírtestekben a dFOXO fehérje többsége még mindig magokban volt (1. ábra). 1J). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a zsír testében a gbb túlzott expressziója gátolja az inzulin jelátvitelt, ami egy inzulinrezisztens fenotípust eredményez, amely hasonló a hosszú távú HFD tápláláshoz.

A Gbb jelátvitel gátlása megmenti a HFD által kiváltott elhízást és a diabéteszes fenotípusokat

( NAK NEK ) A triglicerid és a trehalóz/glükóz szint a pS106 GS> trb + RU-ban nőtt az −RU kontrollokhoz viszonyítva. ( B ) HFD állapotban a zsír testében a trb csökkenése elnyomta a trigliceridek és a trehalóz/glükóz emelkedett szintjét. ( C, D ) A trb eliminációja a zsír testben, amely túlzottan expresszálja a gbb-t (pS106 GS> gbb + trb RNAi + RU), elnyomta az emelkedett triglicerid- és trehalóz-/glükózszinteket, amelyeket a pS106 GS> gbb + RU-ban figyeltek meg. Az adatokat legalább három független kísérlet átlagának ± féléveként adjuk meg. * P 4, 5, ami viszont olyan másodlagos betegségeket okoz, mint például az inzulinrezisztencia 6. Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy a HFD által kiváltott elhízás kiváltja a TGF-β jelátvitelt, amely visszafogja az inzulin jelátvitelt a zsír testben. Bemutatjuk a triplák, a TGF-β/Gbb jelátvitel új célpontjának szerepét az inzulinrezisztencia kialakulásában is.

A drozofilamodelleket számos, az étrend által kiváltott elhízásról, inzulinrezisztenciáról, hiperglikémiáról és hiperinsulinémiáról szóló 29, 30, 31, 32 tanulmányban használták. A Drosophila lárvákban a magas cukortartalmú étrend 2-es típusú diabéteszes fenotípusokat vált ki, amelyek magukban foglalják a hiperglikémiát, a magas TG-t és az inzulinrezisztenciát 31. Hasonlóképpen, a felnőtt legyeknél a HFD-táplálás is magas TG-értéket és megváltozott glükóz-anyagcserét indukál, emlősöknél pedig szívműködési zavarokat, például diabéteszes kardiomiopátiát 29. Ebben a tanulmányban létrehoztuk az elhízás okozta inzulinrezisztencia Drosophila modelljét, amely szembeszökő párhuzamot mutat az emlős rendszerével, és ezt felhasználta az inzulinrezisztencia kialakulásának megfigyelésére és vizsgálatára krónikus túl táplálkozás esetén. Ezenkívül a Drosophila inzulinrezisztencia fenotípusának részletes tanulmányozásához kifejlesztettünk egy ex vivo tenyésztési rendszert (S2E ábra).

Amikor felnőtt legyek HFD-jét etettük, rövid és hosszú távú metabolikus válaszaik eltérőek voltak: például a Dilp2 expresszióját és szekrécióját rövid távon a HFD növelte, de hosszú távon a HFD csökkentette. Az inzulin jelátvitel, amelyet a pAKT aktivációjának és a dFOXO d4E-BP és dInR célgének expressziójának monitorozásával elemeztek, HFD-ben rövid távon, de nem hosszú távon aktiválódott, míg a TG és trehalóz/glükóz szintje a hemolimfában hosszú távon növekedett. HFD kifejezés (S1 ábra). Mivel ezek a kóros fenotípusok a legyekben nagyon hasonlítottak az emlősök inzulinrezisztens cukorbetegségével összefüggő fenotípusokra, arra a következtetésre jutottunk, hogy a HFD-vel rendelkező felnőtt legyek a 2-es típusú cukorbetegség modelljeként használhatók.

Összefoglalva, létrehoztuk a Drosophila inzulinrezisztencia modelljét, és bebizonyítottuk, hogy a zsír testben a Gbb jelátvitel kritikus szerepet játszik az elhízás által közvetített inzulinrezisztenciában azáltal, hogy szabályozza a törzsek expresszióját. Ezek az eredmények információt nyújtanak a Gbb/TGF-β jelátvitel metabolikus betegségben betöltött szerepéről, és arra utalnak, hogy ez az út ígéretes terápiás célpontot jelent az elhízás és a cukorbetegség kezelésében.

Anyagok és metódusok

Drosophila melanogaster készletek

A Drosophila melanogastert növesztettük és 25 ° C-on tartottuk egy ENT-ben, amely 38% kukoricalisztet, 20% élesztőt, 5% cukrot és 2% agart tartalmaz. w 1118 legyet szereztek a Bloomington Stock Center-től, pS106 GS-Gal4-et Dr. M. Tatartól, DCG-Gal4-et Dr. J. Graff-tól, UAS-gbb, UAS-dpp, UAS-UAS-dActβ és UAS-punt DN Dr. M. O'Conner és Dr. M. Milan UAS-tribleiből. Megszereztük az UAS-gbb RNAi, az UAS-dMad RNAi és az UAS-tribbles RNAi vonalakat is a bécsi Drosophila Resource Center-től. A pS106 GS-Gal4 expressziójához felnőtt legyeket tenyésztettünk agar alapú étrenden, 200 μM RU486-tal (Sigma) kiegészítve.

Sejtkultúra, stimuláció és transzfekció.

Az Invitrogen-től megvásárolt Drosophila S2 sejteket 26 ° C-on tartottuk 10% borjúszérummal kiegészített Schneider táptalajban. A HepG2 sejteket 4,5 g/l glükózban tenyésztettük Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) táptalajában, kiegészítve 10% marha magzati szérummal, 2% L-glutaminnal, 100 mU/ml penicillinnel és 100% streptomicinnel/ml 5% CO2 atmoszférában. 37 ° C-on. A táptalajt 2-3 naponta cseréltük. A peptidkezelések előtt a sejteket 8 órán át éheztettük 0,5% BSA-t tartalmazó szérummentes táptalajban, és kémiai inhibitorral vagy hordozóval előkezeltük. TGF-β és TGF-β RI kináz inhibitor II-t (10 mM, Calbiochem) használtunk ezekben a kísérletekben. A transzfekcióhoz a sejteket antibiotikum nélküli táptalajban növesztettük, és kis interferáló RNS-sel (siRNS) transzfektáltuk Xtreme GENE HP (Roche) alkalmazásával. A gbb túlzott expressziója érdekében a teljes hosszúságú gbb cDNS-t a pAc5 (Invitrogen) vektorba klónoztuk.

HFD és teljesítmény

A HFD-t 20% (térfogat/térfogat) kókuszolaj hozzáadásával állítottuk elő az NCD-hez; Ezeket az arányokat alkalmazták az összes HFD-kísérletben. HFD-t 3-5 napos korukban gyűjtött hím legyeknek adtak be.

A test TG szintjének mérése

Harminc felnőtt légy testet gyűjtöttünk össze és homogenizáltunk, és a triglicerid meghatározó készlet (Sigma) segítségével mértük a TG szintet. A TG szint normalizálódott az összes fehérje szintre.

Trehalóz/glükóz szint mérése hemolimfában

A hemolimfát 20 legyből gyűjtöttük össze, és a trehalóz/glükóz koncentrációt a korábban leírt 40 szerint mértük .

RNS tisztítás és kvantitatív RT-PCR elemzés

RNS előállításához 20 legyből gyűjtöttünk zsírtesteket. A teljes RNS-extrakciót és a kvantitatív RT-PCR-t a korábban leírtak szerint végeztük 23. Az mRNS-szinteket a belső normalizációs kontrollként alkalmazott rp49 mRNS megfelelő szintjéhez viszonyított változásokként fejeztük ki. Az adatok elemzéséhez összehasonlító ciklusküszöb (Ct) módszert (User Bulletin 2, Applied Biosystems) alkalmaztunk. Az ebben a vizsgálatban használt primereket az 1. kiegészítő táblázat sorolja fel.

Felnőtt zsír testek ex vivo tenyésztése

A felnőtt zsír testeket Schneider táptalajban boncoltuk, éheztettük 8 órán át 0,5% BSA-t tartalmazó szérummentes táptalajban, és 1 órán át inkubáltuk humán inzulint (100 nM, GIBCO) tartalmazó Schneider táptalajban.

Western blot és immunfestés

A felnőtt zsírtestekből származó teljes fehérjét Drosophila homogenátpufferben (10 mM HEPES, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 10% glicerin és proteáz inhibitor koktél [Sigma]) izoláltuk. Western-blotokat a korábban leírtak szerint végeztünk 22. A foszfo-AKT és dAKT primer antitesteket (mindkettőt 1: 1000 arányban alkalmaztuk) a Cell Signaling-ból nyertük, a torma-peroxidázzal konjugált anti-nyúl IgG szekunder antitestet (1: 2000) a Santa Cruz Biotechnology cégtől. Az immunfestést a fent leírtak szerint hajtottuk végre a dFOXO elsődleges antitesttel (1: 200; Dr. M. Tatar ajándéka) és az Alexa 488 szekunder anti-nyúl IgG antitesttel (1: 200, molekuláris próbák).

A sejteket 0,5% formaldehidben rögzítettük 15 percig. A ChIP elemzést a 23. leírás szerint végeztük. A magok elkülönítése és a kromatinnal végzett ultrahangos kezelés után a DNS egy alikvot részét eltávolítottuk bemeneti kontrollként, és a maradékot normál egér IgG-vel (2 μg, Santa Cruz Biotechnology) vagy egér anti-dMad-mal (2 μg, Santa Cruz Biotechnology) inkubáltuk. A hagyományos PCR-t és qPCR-t bemeneti DNS és immunrecipitált DNS felhasználásával végeztük. Az ebben a vizsgálatban használt primereket a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Luciferáz riportervizsgálat Drosophila S2 sejtekben

A luciferáz vizsgálatokhoz PCR PCR-rel amplifikáltuk őket, szubklónoztuk a luciferáz riporter pGL3 vektorba (Promega) és 1,4 kb genomiális DNS-be a Drosophila trb-től (+60 - −1346), valamint 1, 1 kb (+60 - −1054) irányba. ). trb1.4kb és pGL3-trb1.1kb. A pGL3-trb1.4KbΔMbs-t, a feltételezett Mad junction szekvencia (GACATCCGTCTG) deléciós konstrukcióját a pGL3-trb1.4Kb-ben, átfedéses kiterjesztésű PCR-rel állítottuk elő olyan primerek alkalmazásával, amelyek a deléciót kísérő szekvenciákon 42 ülnek. Ezeket a DNS-konstrukciókat és a pAc5.1A-gbb vagy pAc5.1A fehérje expressziós vektort Xtreme GENE HP (Roche) módszerrel Drosophila S2 sejtekbe transzfektáltuk. 48 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük, és a luciferáz aktivitást a gyártó utasításainak megfelelően Luciferase Reporter Assay System (Promega) alkalmazásával mértük. A teszteket háromszor megismételtük. Az ebben a vizsgálatban használt primereket a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

statisztikai elemzés

Mindegyik kísérletet legalább háromszor megismételtük, és az adatokat átlagként ± sem. A statisztikai elemzésekhez a Student t-tesztet használtuk, és P