Elválasztás és biokémiai jellemzése Az enzim 1,3- PROPANODIOL OXIDORREDUCTASE érkező NATIVE törzset Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA Vasquez Ipari Microbiologist PUJ Code 186286 MICROBIOLOGY Egyetemi Intézet posztgraduális tézis, hogy optimalizálja UNACULTÍA MICROBIROBIOLOGÍA UNIVERSOGRADO EGYETEM MICROBIA GRADUATE DOKTORI UNACULTURAL BIOLÓGIAI INTÉZET. COLOMBIA-tól BOGOTÁ DC, COLOMBIA 2010

enzim-reduktáz

Az 1,3-PROPANODIOL-OXIDORREDUKTÁZ-ENZIM KIVÁLASZTÁSA ÉS BIOKÉMIAI JELLEMZÉSE A Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA VÁSQUEZ Ipari Mikrobiológus P.U.J. Code 186286 igazgató, DOLL. A bioprocesszorok és a bioprospektáló csoport szolventogén mikroorganizmusok egyetemi docense A BIOTECHNOLÓGIA MIKROBIOLÓGIAI INTÉZMÉNYEK Posztgraduális Interfakulációi Kolumbiai Nemzetközi Egyetem BOGOTÁ D.C, Kolumbia 2010

Neked, anya, minden hálám és örök szeretetem, amiért támogattál és mindig velem voltam. Lányomnak a türelméért és szeretetéért, a nővéremért, aki feltétel nélküli barátom, Diegónak és az egész családomnak, hogy támogatják ezt az álmot, amely ma valóság.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Dr. Dolly Montoya Castaño, aki ezt a munkát irányította, hogy lehetőséget biztosított számomra, hogy együtt dolgozhassak vele és egy olyan kutatócsoporttal, amely a tudásnál többet adott az életemhez. Csoporttagjaimnak: Julieth Serrano, Ximena Pérez, Natalia Comba, Mauricio Bernal, Herlinda Amaris, María Angélica Peña, Yenny Rocio Martínez, Carlos Barragán, Gernot Gruss, Andres Gutierrez és mindazok, akik valahogy a mikrobiológiai laboratórium részesei. A mikrobiológia posztgraduális interfakultúrájának, különösen Socorro Prieto támogatásáért és együttműködéséért. Jhon Floreznek, amiért nekem olyan volt, mint egy angyal, az együttműködéséért és a türelméért, köszönöm szépen. Ana Lucia Castiblancónak és Jorge Cortazarnak készségükért és segítségükért. Mesteri fokozatú barátaimnak, különösen Viviannek, Merynek, Carolinának, Osquitarnak és Alexisnek, hogy ilyen jó barátok voltak, támogattak és mindig ott voltam, hogy jó tanácsokat adjak nekem. Kolumbiai Nemzeti Egyetemnek, amiért lehetővé tette a kutatás befejezését és befejezését.

TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÓ 1. BEVEZETÉS 1 2. ELMÉLETI KERET 3 2.1. A biodízel előállítása 3 2.2. 1,3-propándiol 4 2.3. 1,3-propándiol szintézise 5 2.4. A Clostridium sp. Nemzetség mikroorganizmusai 7 2.5. Az 1,3-propándiol képződésének élettana Clostridium sp. 7 2.6. Dehidrogenáz enzimek 9 2.6.1. Az enzimaktivitás kísérleti mérése 11 2.6.2. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzimatikus aktivitásának in situ kimutatása 11 2.6.3. Enzimek megszerzése 12 2.6.4. Enzimtisztítás 13 2.6.5. A teljes fehérjekoncentráció meghatározása 14 2.6.6. Enzimatikus jellemzés 14 2.7. Az IBUN szolventogén vonal bioprocesszorainak és bioprospektáló csoportjának előrehaladása 16 3. ÁLTALÁNOS CÉL 18 Konkrét célok 18 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 19 4.1. Mikroorganizmusok, táptalaj és tenyésztési körülmények 19 4.2. Növekedési kinetika 20 4.3. A nyers fehérjekivonat megszerzése

4.3.1. Nyersfehérje-kivonat előállítása 20 4.3.2. Fehérjék meghatározása fluorometriai módszerrel 20 4.3.3. Az enzimaktivitás meghatározása 21 4.4. 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim tisztítása 22 4.4.1. Fehérje kicsapódás 22 4.4.2. Az enzim szétválasztása és tisztítása 22 4.4.3. A tisztítás ellenőrzése 22 4.4.4. Fehérjeelemzés (PAGE) 23 4.5. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim jellemzése 23 4.5.1. Az optimális hőmérséklet meghatározása 23 4.5.2. Az optimális pH 23 meghatározása 4.5.3. A Km és Vmax kinetikai paraméterek meghatározása 24 4.5.4. A kétértékű ionok hatása 24 4.5.5. Előzetes teszt a molekulatömeg meghatározására 24 4.5.6. Az izoelektromos pont meghatározása 25 5. EREDMÉNYEK 26 5.1. A nyers fehérjekivonat megszerzésének módszere 26 5.1.1. Munkafeszítések 26 5.1.2. Növekedési kinetika 26 5.2. A nyers fehérjekivonat megszerzése 27 5.2.1. Nyersfehérje-kivonat előállítása 27 5.2.2. Enzimaktivitás 28 5.2.3. NAD + H kalibrációs görbéje 29 5.3. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim szétválasztása és tisztítása 29 5.3.1. Fehérje csapadék 30

5.3.2. Elválasztás és tisztítás 31 5.3.3. Fehérjeelemzés (PAGE) 35 5.4. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim jellemzése 36 5.4.1. A hőmérséklet hatása az enzim aktivitására 36 5.4.2. Az optimális pH 37 meghatározása 5.4.3. A Km és Vmax kinetikai paraméterek meghatározása 37 5.4.4. A kétértékű ionok hatása az enzim aktivitására 38 5.4.5. Előzetes teszt a molekulatömeg meghatározására 39 5.4.6. Az enzim izoelektromos pontjának meghatározása 40 6. MEGBESZÉLÉS 41 7. KÖVETKEZTETÉSEK 51 8. AJÁNLÁSOK 52 9. BIBLIOGRÁFIAI HIVATKOZÁSOK 53 10. MELLÉKLETEK 61 10.1. MELLÉKLET 1. NAD + H standard görbe 61 10.2. 2. MELLÉKLET Az enzimaktivitás meghatározása 63 10.3. 3. MELLÉKLET A Clostridium IBUN 158B növekedési görbéje RCM táptalajban (oxoid) 64 10.4. 4. MELLÉKLET A Clostridium IBUN 158 B növekedési görbéje TGY 65 táptalajban 10.5. 5. MELLÉKLET Clostridium IBUN 158B száraz tömege és abszorpciós görbéje (600 nm) TGY 67 táptalajban 10.6. 6. MELLÉKLET Standard görbe az 1,3-propándiol-dehidrogenáz molekulatömegének meghatározására poliakrilamid-gélben denaturáló körülmények között 68

1,3-propándiol-dehidrogenáz 39 19. ábra: Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim aktivitásának százalékos aránya a klorid-sók hatására 39 20. ábra Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim molekulatömegének becslése 10% poliakrilamidban gélek denaturáló körülmények között 40 21. ábra. NAD + H görbe és a Bio-Rad 61 spektrofotométer vonalának egyenlete 22. ábra: NAD + H görbe és a vonal egyenlete a TECAN ELISA leolvasóban 62 23. ábra A szükséges idő kinetikája nagyobb enzimatikus aktivitás eléréséhez 63 24. ábra: Clostridium IBUN 158B növekedési görbéje RCM 64 táptalajban 25. ábra: Clostridium IBUN 158B növekedési görbéje TGY 66 táptalajban 26. ábra: Clostridium IBUN 158B száraz tömeg görbéje Vs Abs 600 nm TGY 67-ben táptalaj 27. ábra. A Coomassie Blue 68-mal festett 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim tömegének becsléséhez használt standard molekulatömeg görbe. Mar az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim tömegét a 68-as Zymogram-ból

17. táblázat: A száraz tömeg (g/l) és az Abs (600 nm) 67 görbéjéből kapott kinetikai paraméterek

3. ÁLTALÁNOS CÉL: Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim beszerzése, szétválasztása és jellemzése a Clostridium IBUN 158 B natív törzséből. 3.1. KÜLÖNLEGES CÉLKITŰZÉSEK: Olyan módszer szabványosítása, amely lehetővé teszi a nyersfehérje-kivonat megszerzését a Clostridium IBUN 158 B natív törzs tenyészetéből, a Kolumbiai Nemzeti Egyetem Biotechnológiai Intézetéből. Az elválasztási módszerek értékelése gélszűréssel és ioncserével FLPC rendszerben az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim elválasztásához a Clostridium IBUN 158 B törzstől. Határozza meg az enzimatikus aktivitást, pH-t, optimális hőmérsékletet, kinetikai paramétereket, molekulatömeget és az ionok hatása a tisztított 1,3-propándiol-dehidrogenáz 18 enzim aktivitására

Előre festett A 178 B 120 C 78 D 51 E 40 F 25 G 18 H 12 I 10 4.5.6. Az izoelektromos pont meghatározása Elméletileg meghatároztuk a Montoya (2008b) által az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzimre kapott fehérjeszekvenciát, amelyet a Clostridium IBUN 158B NCBI adatbázisában publikáltunk, és az EMBnet intézet bioinformatikai eszközét használtuk. biotechnológia alkalmazásával az enzim izoelektromos pontjának kiszámításához. 5. EREDMÉNYEK 5.1. Módszer a nyers fehérjekivonat előállítására 25

5.2. A nyers fehérjekivonat megszerzése 5.2.1. A nyersfehérje-kivonat előállítása Mivel a vizsgálat szempontjából érdekes enzim intracelluláris, a Clostridium IBUN 158B-ből a fehérjék előállítását ultrahanggal kezeltük, a módszer anyagaiban leírtak szerint. Megfigyelték, hogy a ciklusok növekedésével az intakt mikroorganizmusok száma csökkent és a sejttörmelék növekedett, amit a sejtek átesett lízisfolyamatának köszönhetően mutattak be (8. ábra). 8. ábra: A natív Clostridium törzsek Gram-festése. IBUN 158B az egyes ultrahangos ciklusok és idők után. Teszt 4 C-on, 60 KHz-en, 30 másodperces időtartamokkal A sejteket többször ultrahanggal kezelték, és megállapították, hogy a homogén és a nagyobb fehérjetermelés érdekében a mintákban a 12. ciklusban optimális feltételeket értek el. 30 másodperces ultrahangos kezelés, 27 pihenőidő

1 2 3 4 13. ábra: Commassie Blue festés. Denaturáló körülmények 10% -nál. 1. kút: negatív kontroll, 2. kút: pozitív kontroll, 3. kút: tiszta 1,3-PDD enzim, 4. kút: 190 KDa MP. 5.4. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim jellemzése 5.4.1. A hőmérséklet hatása az enzim aktivitására Az értékelendő hőmérsékleti tartomány megválasztásának előzetes tesztjeként a minták enzimatikus aktivitását két példányban, 20 és 40 ° C közötti hőmérséklet-tartományban határoztuk meg. a kapott eredmények nagyobb enzimatikus aktivitást mutattak 30 C hőmérsékleten. Ezekből az eredményekből egy szűkebb hőmérséklet-tartományt értékeltek, amelyet 25 C és 31 C között állapítottak meg (14. ábra), ami lehetővé tette számunkra, hogy megerősítsük az első tesztben találtakat. 14. ábra: A hőmérséklet hatása az enzimatikus aktivitásra 25 és 31 C közötti hőmérséklet-tartományban. 5.4.2. Az optimális pH meghatározása Az értékelendő pH-tartományok megválasztása olyan vizsgálatok figyelembevételével történt, amelyek során az ilyen típusú enzimeket értékelték. A (15. ábra) hatásában, hogy a 36

16. ábra: Az 1,3-propándiol-koncentráció milliméterben kifejtett hatása az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim aktivitására 0,6 mm NAD + koncentráció alkalmazásával. 17. ábra: A NAD + koenzim koncentráció hatása a 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim, 100 mm-es 1,3-propándiol-koncentráció alkalmazásával 5.4.4. A kétértékű ionok hatása az enzimaktivitásra A 18. és 19. ábrán a klorid-sók és azok koncentrációjának a tisztított enzim aktivitására gyakorolt ​​hatása látható, jól látható, hogy a mangán-klorid-sók és a kalcium-klorid aktivátorok és potencírozók 38

enzimaktivitás, míg a magnézium-klorid-sók akár 19% -kal elnyomják annak aktivitását. A mangán-klorid 50% -kal növeli az enzim aktivitását a kalcium-klorid által generált 7% -hoz képest. 18. ábra: A kétértékű ionok hatása az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim aktivitására 19. ábra Az 1,3-as enzim aktivitásának százalékos aránya -propándiol-dehidrogenáz a klorid-sók hatása ellen. 5.4.5. Előzetes teszt a molekulatömeg meghatározására Figyelembe véve a tisztítási folyamat után kapott elektroforézis eredményeit és az enzim hozzávetőleges molekulatömegének meghatározására szolgáló módszerként a sávok útjának értékeit mm-ben gél, a 39 súlyjelző szalagjainak méretéből kapott vonal egyenletének felhasználásával

(190 KDA) 10% poliakrilamid géleken (20. ábra). A kapott eredmény 71,3 KDa tömeg volt az egyetlen sáv esetében a Coomassie Blue-val festett gélben, és 74,5 KDa tömeg volt a zymogramban bizonyított sávban. 1 2 3 4 1 2 3 4 71,3 KDa 74,5 KDa (a) (b) 20. ábra. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim molekulatömegének becslése 10% -os poliakrilamid gélekben denaturáló körülmények között (a) Coomassie Blue-val festett ( b) Zymogram. Az (1) lyukak tartalmazzák a 190KDa kereskedelmi súlyjelzőt (Bioline), a (2-4) üregek pedig a tisztítási folyamat után az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzimet tartalmazzák. 5.4.6. Az enzim izoelektromos pontjának meghatározása a Bioinformatikai eszközök alkalmazásával kapott eredmények szerint; a Clostridium IBUN 158B 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzimére Montoya (2008b) által megállapított szekvenciából származó 385 aminosavból előállított elméleti pi értéke 5,85 40

7. KÖVETKEZTETÉSEK Megállapítható volt, hogy a Clostridium IBUN 158B natív törzséből származó 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim allosztérikus viselkedést mutat, amely egybeesik a Bioprocesses csoport által kapott bioinformatikai adatokkal, amelyek publikálás alatt állnak. Az enzimatikus aktivitást az erjesztés során nagymértékben befolyásolják olyan tényezők, mint a pH és a savtermelés, amelyek összefüggenek a redukálószerek, például a NAD + H áramlásával. Az optimális feltételeket a magasabb enzimatikus aktivitás elérésére 30 C hőmérsékleten, pH 10,0, 1 mm MnCl 2 koncentrációban, 1,3-PD 100 mM és NAD + 2 mm hőmérsékleten érték el. Kimutatták, hogy a becsült molekulatömegre vonatkozóan a vizsgálat során kapott eredmény nem megbízható, ezért ajánlott megerősíteni gélszűrő kromatográfiával és tömegspektrometriával. 51

8. AJÁNLÁSOK Szükséges a glicerin-dehidratáz enzim tisztítása és jellemzése, mivel ez fontos szerepet játszik a glicerin 1,3-propándiollá történő átalakulásában is. Irányítson olyan szabályozott fermentációs körülményeket, amelyek magasabb enzimaktivitási értékeket képesek létrehozni, anélkül, hogy az injekciós üveg fermentációs folyamata során a savtermelés befolyásolná. A metabolikus fluxus viselkedésének tisztázása a glicerin útvonalon belül ajánlott elemezni az enzimatikus aktivitást a savtermelés szempontjából. A natív C. IBUN 158B törzsből származó 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim aktivitásának növelése érdekében néhány nyomelemet, például MnCl 2-t és CaCl 2-t kell használni a TGY táptalajjal és az RCM 52-vel végzett fermentációs folyamatokon belül.