A centrifugálás egy ülepítési technika, amelyet a centrifugális erő alkalmazásával gyorsítanak fel. A következők keverékeinek elemzésére vagy elválasztására vonatkozik részecskék, sejtek, organellumok vagy molekulák.

alaktól függ

A centrifugálás elmélete és a kvantitatív szempontok: lásd Luque, 123. o. Vagy Freifelder, 298. o.

Hangszeres

1. Cső

Üvegből vagy műanyagból. Kémiailag ellenálló (oldószerek, reagensek) és fizikailag (feszültség az alkalmazott nagy sebességnél). Különböző méretű és alakú. Speciális műanyagok nagy sebességhez.

2. Centrifugák

Szabályozhatja a sebességet, az időt, a hőmérsékletet. Nagy sebesség (10 2 -10 5 1/perc).

3. Rotorok

Kétféle: szögletes vagy rögzített szögű rotor lengőkar rotor

Modalitások

A sebesség szerint:

Hozzávetőleges kritérium:
Kis sebességű centrifugálás kevesebb, mint 10 000 fordulat/perc
Nagy sebességű centrifugálás 10 000 és 20 000 fordulat/perc között
Ultracentrifugálás több mint 20 000 fordulat/perc

A célnak megfelelően:

1. Analitikai centrifugálás

Cél: megmérjük a leülepedő részecskék fizikai tulajdonságait, például ülepedési együtthatójukat vagy molekulatömegüket. Különösen a változatban ultracentrifugálás analitika.

A molekulákat optikai rendszeren keresztül figyeljük meg alatt centrifugálás. A centrifuga csövének kvarcnak kell lennie, hogy a látható és az ultraibolya fény áthaladjon. Swing rotor, függőleges megfigyelés.

2. Preparatív centrifugálás

Leggyakrabban használt. Cél: izoláljon részecskéket, sejteket vagy molekulákat elemzés céljából vagy későbbi felhasználás céljából. Általában nagyobb mennyiségű mintát használnak fel, mint az elemzésben.

Attól függően, hogy milyen közegben centrifugálják, és a minta felvitelének módjától:

1. Differenciál centrifugálás

(Más néven mobilhatár). A csövet mintával töltjük meg és centrifugáljuk. A minta egyes komponenseinek viselkedése alakjától, méretétől, sűrűségétől függ és logikailag a centrifugálási körülményeket. Csak 2 frakciót kapunk: üledéket és felülúszót.

[Megjegyzés: a csapadék szó alkalmasabb oldhatatlan dologra, amely centrifugálással vagy más mechanizmusokkal (pl. Kémiai reakcióval) csapódik le; üledék helyesebb, ami arra kényszerült, hogy az aljára menjen, de még mindig oldódik; pellet egy angol szó, ami centrifugálás eredményeként az aljára tömörül]

A kb tipikus az szubcelluláris frakcionálás (a sejt különböző komponenseinek, főleg az organellumok elválasztása) (lásd Luque vagy Alberts), egymást követő centrifugálással, növekvő sebességgel.

2. Zonális vagy ülepedési sebességű centrifugálás

A mintát vékony rétegben visszük fel a centrifugáló közegre, amely a sűrűség gradiens. Centrifugális erő hatására a részecskék a gradiensen keresztül diszkrét zónákban vagy sávokban koncentrálódnak. Haladási sebességed (és ezért az elválasztó mechanizmus) méretétől, alakjától és sűrűségétől függ; mindezek a paraméterek kombinálódnak az ülepedési együtthatóban,

" Ülepedési együttható "= s = (" az ülepedés sebessége ")/(" centrifugális gyorsulás ")"

amelyet svedberg egységekben mérünk (1 S = 10 −13 másodperc).

A centrifugálásnak véget kell érnie, mielőtt bármelyik elválasztott részecske eljutna a cső aljára. A különálló komponenseket külön-külön gyűjtik össze a különféle sávok nagyon óvatos leszívásával, vagy jobb esetben a cső aljának átlyukasztásával és a leeső folyadék frakcionált gyűjtésével.

A szétválasztás animációja látható.

A sűrűségi gradienst egy koncentráció-gradiens hozza létre: növekszik a megfelelő komponens koncentrációja a csövön lefelé haladva. Ehhez szacharózt, cézium-kloridot, albumint, szarvasmarha magzati szérumot használnak. vagy kereskedelmi média, például Ficoll - szintetikus poliszacharid -, Percoll, metrizamid.

Felkészülhet:
még szakaszos gradiens vagy lépcsőzetesen, manuálisan
b) a folyamatos gradiens, gradiensképző eszköz segítségével
c) a saját alakú folyamatos gradiens, ha centrifugálással állítják elő, általában a minta frakcionálásával egy időben

A) Folyamatos sűrűséggradiens előállítása keverővel.

B) A minta alkalmazása a gradiensen.

C) A csövek elhelyezése billenő rotorban és centrifugálás.

D) Az elválasztott komponensek frakcióban történő összegyűjtése.

Ezzel a technikával lehetséges például az összes vérsejt-típus szétválasztása, az életképes spermiumok megtisztítása, az életképes és életképtelen sejtek szétválasztása a lebontott szövetektől és a minták szuszpenziós sejtekkel stb.

3. Izopiknikus vagy ülepedési egyensúlyi centrifugálás

Sűrűségi gradienst is használunk, de ebben az esetben a centrifugálási idő elég hosszú (legfeljebb 1 vagy 2 nap), hogy a ülepedési egyensúly (a centrifugális erő, a cella hidrosztatikus nyomása és diffúziója között). Ennek eléréséhez folyamatos gradienseket alkalmaznak, amelyek lefedik a minta komponenseinek teljes sűrűségtartományát: a cső alján a közeg sűrűségének nagyobbnak kell lennie, mint a legsűrűbb komponensének. Ilyen módon, függetlenül a centrifugálási időtől, a részecskék, sejtek stb. Soha nem telepednek le az aljára, hanem stabil gradiens közepes helyzetbe kerülnek, ahol nagyon keskeny sávban koncentrálódnak (jobb felbontás). A leggyakoribb az, hogy a mintát összekeverjük azzal az anyaggal, amely a színátmenetet képezi, és az elválasztással egyidejűleg egy saját maga kialakított gradienst generál. A gradiens kialakulásához nagyon nagy sebességre van szükség (ultracentrifugálás).

A nagyobb felbontás mellett ennek a technikának az az érdekessége, hogy elválasztja egymástól kizárólag a sűrűség szerint a minta azon komponensei közül, amelyek a gradiens helyzetében helyezkednek el, ahol a közeg sűrűsége megegyezik a sajátjával (izopiknikus = egyenlő sűrűségű, görögül).

Összehasonlítás és kiegészítő információk:

Forgórész általában szögletes.

Elválasztás főként a méret, de az ülepedési együttható alapján is s, amely a tömegtől (méret × sűrűség) és az alaktól függ. (Svedberg-ben mérve, 1S = 10-13 másodperc)

App: sejttípusok szétválasztása, szubcelluláris frakcionálás (organellák elválasztása), makromolekuláris asszociációk elválasztása stb.

Forgórész lengőkar.

Elválasztás az ülepedési együttható függvényében s, ami a tömegtől és az alaktól függ. A gradiens megakadályozza a konvekció/diffúzió keveredését: jól elkülönített sávok. A centrifugálást az egyensúly elérése előtt leállítjuk. A minta komponenseinek sűrűségi gradiensének maximális sűrűsége.

App: nukleinsavmolekulák elválasztása, nukleinsavtisztítás stb.

4. Korlátozó módszerek

Gyors módszer, amely jellemző például a keringő vér leukociták megszerzésére a többi vérsejttől mentesen. Ez egy állandó sűrűségű közegen keresztüli centrifugálás (egyetlen lépés lépcsőzetes gradiensének tekinthető). Ennek az ágynak a sűrűségének közepesnek kell lennie az elválasztandó sejttípusok között. Ehhez olyan kereskedelmi közegeket használnak, mint a Ficoll-Paque, a Lymphoprep és még sokan mások, általában Ficoll (szintetikus poliszacharid) és metrizamid (jódozott szintetikus vegyület) keverékéből. Különböző, megfelelő sűrűségű táptalajok állnak rendelkezésre a specifikus sejttípusok szétválasztására; pl. Nycoprep 1,077 mononukleáris sejtek esetén, Nycoprep 1,068 monociták esetén, Polymorhoprep polimorfonukleáris sejtek esetén vagy Nycoprep 1,063 vérlemezkék esetén.

Számítások

Átalakítás forgási sebességről (fordulat/perc, rpm) centrifugális gyorsulásra (relatív centrifugális erő, RCF, egység nélküli):

Ugyanaz a szétválasztás érhető el 2 különböző centrifugában, ha az FCR megegyezik, nem akkor, ha a forgási sebesség (rpm) megegyezik. Ezért fontos, hogy a centrifugálási körülményeket FCR-ben adjuk meg, ne fordulat/percben. .

Az FCR az, amit köznyelven „gének számának” nevezünk, mert a gravitáció gyorsulásának egységeként mérik., g. Így fejezik ki például "15 perc centrifugálás 20 000 g-nál" (vagy "20 000 x g-nál").

A kettő közötti kapcsolat a rotor sugarától függ (a forgástengelytől a minta helyzetének méréséig a csőben) az alábbiak szerint:

A centrifugálás útján történő elválasztás a sejt tömegétől ("m"), a cső girációs sugarától - vagy a rotor sugarától - függ, ahová a mintát helyezzük ("r") és a centrifuga által elért sebességtől ("omega"). vagy `n`):

`F_c = m * a = (m * v ^ 2)/r = (m * e ^ 2)/(r * t ^ 2) = (m * phi ^ 2 * r ^ 2)/(r * t ^ 2) = (m * phi ^ 2 * r)/t ^ 2 = m * omega ^ 2 * r = `

"F_c" = centrifugális erő
"m" = a sejt tömege
`a = v ^ 2/r` = gyorsulás; az egység gravitációs üledékképzéséhez "a = g =" 9,8 m/s 2 = 980 cm/s 2
"v = e/t" = a minta lineáris sebessége a csőben (cm/perc)
"r" = forgási sugár, a centrifuga csőjének középpontja és a forgástengely között mérve (cm)
"e" = megtett lineáris tér, ha a mozgás lineáris lenne (cm)
"t" = centrifugáláskor alkalmazott ülepítési idő (perc)
"phi" = a forgási mozgásban megtett szög (radián = szög, amelynek íve egyenlő az "r" -vel); "phi = e/r"
`omega = phi/t` = szögsebesség, mivel a mozgás forgó (rad/min = min −1)
"n" = forgási sebesség (fordulat/másodperc = rps, vagy fordulat/perc = rpm); `omega = 2pi \ n`

A relatív centrifugális erő kiszámítása:

"FCR = F_c/(F_g) = a/(g) = (39,48 * m * n ^ 2 * r)/(m * 980 (cm)/s ^ 2) = 0,0403 * n ^ 2 * r \ \ cm ^ -1 * s ^ 2`

Ha elkülönítjük a szokásos mértékegységeket (fordulatszám fordulatszámban és sugár cm-ben):

Ami általában "FCR = 11.19 * 10 ^ -6 * n ^ 2 * r" vagy "FCR = (n ^ 2 * r)/89365"
amely feltételezi, hogy az `n` fordulatszámban van, az` r` cm-ben

Példaként nézzünk meg egy megoldott gyakorlatot:

Az 5 cm sugarú centrifuga rotorban elért „g” száma 10 000 fordulat/perc sebességgel forog:
"FCR = (10000) ^ 2 * 5/89365 = 5600xxg"

Kényelmes tudni, hogyan kell kezelni ezt az átalakítást.

Az FCR kiszámítása fordulatszámból és fordítva a rotor különböző forgási sugaraihoz.