Jóváhagyás: 2017. október 11
Kulcsszavak: Gyomor, gasztroszkópia, lélegzetvizsgálat, fekély.
Kivonat: A lovak fekélyes gyomor szindróma (EGUS) egy multifaktoriális entitás, amely gyomornyálkahártya elváltozásokat okoz. Az EGUS-t olyan kockázati tényezőkhöz társították, mint például az állattartás, a gabonaellátás, a testmozgás miatt fellépő hypergastrinemia, a stressz, a nem szteroid gyulladáscsökkentők (NSAID) és a dysbiosis (Helicobacter spp.). A vizsgálat célja a Helicobacter spp. Kimutatása volt. a ló gyomornyálkahártyáján és annak összefüggését az EGUS-szal. Húsz, különböző fajtájú, mindkét nemű, istállóban tartott lovat értékeltek. Nyelőcső-gasztro-duodenoszkópiát és a mirigy nyálkahártyájának biopsziáját végeztük. A mintákat Urease Rapid Testnek (URT) vetették alá, és Urea Breath Testet (UBT) végeztek a vizsgált populációban. Leíró statisztikákat, valamint érzékenység/specifitás tesztet fejlesztettek ki. Az ureaztermelési tesztek kevésbé voltak érzékenyek az „arany standard” tesztre (karbamid-agar); Nem sikerült meghatározni az ureáz tesztek és a Helicobacter spp jelenléte, vagy az EGUS közötti megfelelést. A tesztek és az EGUS vagy Helicobacter spp. Közötti összefüggést nem határozták meg, molekuláris diagnózist igényel.
Kulcsszavak: Gyomor, gasztroszkópia, karbamid légzési teszt, fekély.
A Helicobacter egy Gram-negatív, mikroaerofil, spirális, flagellátus baktérium, amelyet kezdetben a Campylobacter nemzetségbe soroltak, de 1989-ben átkategóriázták [14], köszönhetően a gyomorbetegségben szenvedő emberek pylorus antrumában talált mikroorganizmusnak, az ún. azóta Helicobacter pylori. Bár legismertebb formája a spirál, pleomorf. A gömbformák (kokcoidok) tápanyaghiány, antibiotikumoknak való kitettség vagy hosszú inkubációs idő alatt jelennek meg. Feltételezzük, hogy ezek a formák visszatérnek a bacilláris megjelenítéshez a speciális környezeti feltételek szerint, visszaadva fertőző képességüket [1, 14].
A Helicobacter nemzetség közül a legismertebb biokémiai profil a H. pylori, amelynek legjelentősebb enzimatikus aktivitása a karbamid hidrolizálásának képessége, valamint alkalikus foszfatáz, oxidáz és kataláz aktivitással rendelkezik. Bár az ureaz aktivitást viszonylag gyakorinak tartják a Helicobacter fajok között, ezeknek a baktériumoknak az állatok gyomornyálkahártyájában található enzimaktivitása és szöveti hatása különbözik.
A lófélék (Equus ferus caballus) gyomornyálkahártyájában található mikroorganizmusok - mind egészségesek, mind fekélyesek - kapcsolatban vannak a Helicobacter nemzetséggel [3, 7, 8, 16], többek között a H. equorum [12]; Ugyanakkor a Helicobacter részvétele a ló gyomorfekélyes szindróma (EGG) patogenezisében még nem bizonyított, bár feltételezhető, hogy jelenléte a lovak gyomornyálkahártyájában potenciális kockázati tényező a kérdéses szindróma szempontjából. Emiatt a jelen tanulmány célja a baktériumok ureázaktivitási teszteken keresztüli kimutatása volt, amellett, hogy megállapította az összefüggést a SUGE és jelenléte között.
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
A tanulmány típusa és etikai szempontok
Leíró, prospektív, keresztmetszeti vizsgálatot végeztek kényelmi mintavétellel. A tanulmányt az Antioquia Egyetem állatok gondozásával és felhasználásával foglalkozó intézményi bizottság jóváhagyta a 3082013 protokollon keresztül.
Nyelőcső - gasztro - duodenoscopia
Gasztro-duodenoszkópiát végeztünk, tizenkét, illetve négy órán át (h) koplalva szilárd és folyékony étel esetén. Szedációt végeztünk 10% xilazinnal (Anased®, Lloyd Laboratories, Iowa, USA) (0,5 mg/kg/IV). Ezt követően endoszkópiát végeztünk egy video endoszkóp rendszerrel (PortaScope®, 1800PVS, Bradenton, FL, USA). A makroszkópos eredményeket a gyomorelváltozások mértékének osztályozási skálája szerint osztályozták, amelyeket MacAllister et al. [tizenegy].
Az endoszkóp körút során vizet csepegtettek a gyomornyálkahártya vizualizációjának javítására. Miután elvégeztük a gasztroszkópos kiértékelést és az elváltozások osztályozását, három biopsziát vettünk a gyomor felületéről, a mirigy nyálkahártyájáról (fundus) és a pylorus antrumból, egy rugalmas transz-endoszkópos csipesz behelyezésével (PortaScope®, 1800PVS, Bradenton, FL, USA), gyors ureázvizsgálatok (PRU) elvégzésére.
Gyors Urease Test (PRU)
A PRU elvégzéséhez módosított karbamidlevet készítettek [13], amely 500 ml desztillált vízből állt; 100% karbamid (Merck, Darnstadt, Németország) 10 g; fenolvörös 0,005 g; 0,2% 97% -os sósav; a kapott pH 7 volt, pH-indikátor csíkon át mérve. A levest 0,5 ml-es térfogatokban alikvotizáltuk, és 2 ml-es kriovialokban helyeztük el, mindegyik felvett biopsziát teljesen belemerítettük a húslevesbe és felcímkéztük. A húslevesben lévő mintákat szobahőmérsékleten 12 órán át inkubáltuk későbbi olvasás céljából.
Az ureázreakció azon alapult, hogy karbamidban gazdag közeg volt pH-indikátort (fenolvörös) is tartalmazva. Amikor az ureáz enzim forrását (ebben az esetben az ureáz aktivitású mikroorganizmusokat) mártották, a közegben jelen lévő karbamid hidrolizálásáért volt felelős; A reakcióból származó ammónium és szén-dioxid felszabadulása alkalmassá tette a táptalajt és színváltozást váltott ki sárga (negatív) és intenzív vörös-fukszia szintre, ami pozitív reakciót jelez az ureázaktivitásra (1. ábra).
Húsz mirigynyálkahártya-mintát vettünk két példányban karbamidlevesnek és karbamid-agarnak ("arany teszt") alávetve, amelyet az Antioquia Egyetem Agrártudományi Karának Állat-egészségügyi Mikrobiológiai Laboratóriumában használtak, annak érdekében, hogy érvényesítsék az eredményt mindkettő között. média. A karbamid-agar egy alapgélből (Urea agar Base Christensen® Merck Millipore, MA, USA) 3,6 g, karbamid-sóból (Carlo Erba Reagents SAS, Chaussée du Vexin, FR) 7,5 g és 5 csepp 97% -os sósavból állt. . A húsleves hatékonyságának igazolása érdekében egy pozitív ureázaktivitású mikroorganizmus (Proteus spp.) Oltóanyagát használtuk.
Légzési teszt (Urea Légzési teszt - UBT)
Mindegyik ló alaplégzését vettük, egy üvegcsövet (Exetainer® Vial for 13C breath Testing, Labco limited, Egyesült Királyság) egy orrlyukba vezetve, miközben az ellenoldali egyidejűleg el volt zárva, amikor a ló lejárt, a csövet azonnal lezártuk. Ezt követően mindegyik egyedet az endoszkóp szonda munkacsatornáján keresztül adagoltuk, 50 mg C13 karbamidot (U23001 tétel) 5 ml vízzel hígítva és közvetlenül a gyomor nyálkahártyájára kenve. Ezután 10 perccel a reagens beadagolása után egy második lélegzetet (lejárat) vettünk egy másik üvegpalackba. Mindegyik csövet izotóparányú tömegspektrométeren (ABCA2 Automated Breath CO2 Analyzer, Sercon® limited, UK) olvastuk le. A 2Δ-nál (delta) nagyobb gázarányt bizonyító eredményt pozitívnak tekintették. A várható kémiai reakciót a következő egyenlet képviseli: 13 CO (NH2) + H2O → 2 NH 3 + 13 CO2
Statisztikai elemzés (diagnosztikai vizsgálatok érzékenysége és specifitása)
A diagnosztikai tesztek valódi pozitív ureázreakciók kimutatására való képességének meghatározásához elvégeztük a ROC görbék (a vevő működési jellemző görbéjének) összehasonlítását a PRU, az UBT és a karbamid agar között („arany teszt”). Ezt az elemzést az EPIDAT® V 3.1 szoftverrel végeztük.
Eredmények és vita
Nem volt szignifikáns távolság a standard vonal (átlós) és az értékelt PRU és UBT görbék között (2. ábra), ami azt jelezte, hogy az eredmények a véletlennek tulajdoníthatók, és nem az arany tesztnek való megfelelésnek (Chi teszt 2 = 0,1728; P értéke = 0,67777). A ROC görbe elemzés azt mutatta, hogy sem a PRU, sem az UBT nem érzékeny az ureázaktivitás kimutatására (I. TÁBLÁZAT) az arany teszthez képest.
SE = standard hiba; CI = konfidencia intervallum; PRU = Gyors ureaz teszt; UBT = Karbamid légzési teszt
(II. TÁBLÁZAT) részletesen bemutatja az egyes elvégzett vizsgálatok eredményeit a ló szerint. Meg kell jegyezni, hogy a mirigy nyálkahártyájának töredékeit választották, mivel ez az a rész, ahol a Helicobacter spp. Nem sikerült kapcsolatot létesíteni a PRU és az UBT tesztek között, sem az egyes, sem pedig a karbamid agaron végzett ureázreakció között.
PRU = Gyors ureaz teszt; UBT: Karbamid légzési teszt; M. mirigy = mirigy nyálkahártya.
Amikor értékeltük a PRU vagy az UBT képességét a gyomorfekély előrejelzésére, nyilvánvaló volt, hogy semmilyen körülmények között sem volt hajlamos a pozitívok gyakorisága azokra az egyénekre, akiknél fekély jelentkezett (bármilyen fokú).
A PRU-t nem minden állat gyomor-régiójában hajtották végre, elsősorban azokra számítottak, amelyek ≥2 (súlyosság) fokú gyomorelváltozásokat igazoltak. Amint azt a 2. ábra mutatja. A 2. ábrán és az I. TÁBLÁZATBAN kiderült, hogy az aktivitás detektálási tesztek nem voltak túl érzékenyek a választott arany tesztre (karbamid agar). Néhány „gyenge pozitív” eredmény a PRU-ban szintén gyenge pozitív volt az UBT szempontjából, ezt a helicobacteriosis magyarázza, mivel a H. pylori súlyos elváltozás előidézésével csökkenti az ureáz aktivitását; Az UBT-teszt ezen viselkedését emberek bizonyítják, hogy bár pozitívak és a Helicobacteriosis-szal kompatibilis klinikai képet mutatnak, kétes pozitívak az UBT-vel szemben.
Lehetséges, hogy az ureázaktivitás-kimutatási tesztek jobban működnek a felszíni elváltozásokban, mert ezen a szinten a kommensális mikroorganizmusok diszbiózisa nem fordult elő, ezzel szemben súlyos sérülés esetén a mikroorganizmusok szubsztrátja eltűnik, és végül csökkennek vagy elpusztulnak. Beszámoltak arról, hogy az endoszkópia során a gyomor ideiglenes beszivárgása zavarja az UBT-t, mivel a mesterséges oxigénellátás befolyásolja az ureáz aktivitását, ráadásul a rossz éhezés interferenciát okoz az ételmaradványok és az ureáz aktivitása között.
Másrészt ismert, hogy léteznek más mikroorganizmusok is, amelyek ureázt termelnek a lovak gyomrában, például Proteus miribialis, Pseudomona aureginosa [2], Klebsiella spp. és a Yersinia spp. [7], amely összetévesztheti az ureázaktivitási tesztek eredményeit, és ezáltal meggyőzővé teheti őket a Helicobacter spp. [7]. Lactobacillus salivarius-t és Sarcina ventriculust találtak, mind egészséges lovak gyomornyálkahártyáján, mind fekélyes elváltozásoknál; ezenkívül fekélyes elváltozásban Enterococcus faeciumot és Escherichia fergusonii felületes, illetve intraepitheliális rendellenességet találtak [10]. Másrészt a H. equorum, amelyet kifejezetten egészséges és beteg lovaktól izoláltak, nem rendelkezik ureázaktivitással [9], ami arra utal, hogy ezen mikroorganizmusok egy része részt vehet a SUGE patofiziológiájában, és nem található meg az ureáz aktivitás tesztjei.
Az ureáztesztek másik problémája a SUGE-ben szenvedő betegek lehetséges gyomorsavtartalma, ezt a Helicobacter gyomor pH/ureáz aktivitási görbéje magyarázza; az ureázaktivitás csúcsa a gyomor 7,5-es pH-jánál következik be, 4,5-nél alacsonyabb pH-érték nincs kimutatható és 4-es pH-értéknél az inaktiválás visszafordíthatatlan [9], ami azt jelenti, hogy azoknál az egyéneknél, ahol feltételezték, hogy ugyanaz a gyomor pH-értéke 4 a teszt hamisan negatív lehet a Helicobacter spp. Jelen tanulmány esetében a pH-t nem mértük a gyomor különböző részeiben, ezért ezeket az információkat nem lehetett megerősíteni. Ideális ellenőrizni a gyomor pH-ját, és összefüggésbe hozni a fekélyek megjelenésével a gyomor különböző régióiban, az ureázaktivitással való megfelelés mellett [4].
Ezenkívül egyes epigenetikai tényezők (a nikkel, mint apoenzim) és genetikai tényezők, mint például az mRNS képessége az ureáztermelést szabályozó gének sorrendjének megfelelő lefordítására, megállapították, hogy befolyásolják az ureáz kimutatási tesztek érzékenységét. A Helicobacter intrabakteriális ureáz aktivitását legalább három módon szabályozzák: egyrészt gyors reakció az UreI aktiválásával; másodszor, az enzim fokozott aktiválásán alapuló lassabb válasz, harmadszor pedig az új ureáz szintézisét serkentő krónikus messenger RNS válasz; Mindezek a tényezők arra utalnak, hogy létezhetnek ureáz-pozitív mikroorganizmusok, mint például a Helicobacter spp., Beleértve a SUGE-ben való részvételt is, de előfordulhat, hogy az ureáz-kimutatási tesztekkel nem könnyen detektálhatók.
Lehetséges lenne megfontolni a tesztek azonos körülmények között történő megismételését a változékonyság és reprodukálhatóság meghatározásához [15], vagy például duplikált elemzéseket végezni. A teszt variabilitását a beteg által tapasztalt fertőzés szakasza [15] és a minta önmagában vett pH-értéke is meghatározza, ami késleltetheti a fenolvörös reakciót; így a tesztek kidolgozása során néhány hamis pozitív és hamis negatív eredmény megtalálható, valamint a klinikai tünetek és az összegyűjtött paraklinikai bizonyítékok kombinációja a legjobb módszer a Helicobacteriosis diagnosztizálására lovaknál. Ezenkívül a molekuláris diagnózist kulcsfontosságú eszköznek tekintik a Helicobacter spp. Jelenlétének tisztázása során. ezen lófélék gyomornyálkahártyájában.
A Helicobacter spp. Izolálásának nehézségei A SUGE-ben való részvételének megerősítése érdekében a tanulmány egy II-es típusú hibát mutat be, vagyis megerősíti, hogy a mikroorganizmus nem kapcsolódik a gyomorelváltozások jelenlétéhez, amikor ténylegesen társul; Más ureáz-pozitív mikroorganizmusok részvétele azonban I. típusú hibákhoz vezethet, társítva a pozitivitást a SUGE bemutatásával, amikor annak ok-okozati viszonya nem igazán biztos. Számos tanulmány azonban beszámolt a Helicobacter fajokkal kompatibilis mikroorganizmusok jelenlétéről, ép, fekélyes és gyulladt gyomornyálkahártyában [8], ami vitát váltott ki a SUGE-ben való részvételükről. Következésképpen továbbra is molekuláris vizsgálatokra van szükség annak relevanciájának meghatározásához a ló gyomor patológiájában, amint ez az embereknél egyértelmű.
Ebben az értelemben egy chilei, állami ellátásban részesülő állatokon végzett vizsgálat 65% pozitív ureázreakciót és ívelt spirális Helicobacter típusú baktériumok megfigyelését mutatta a szemfenéken és a pylorus antrumban fekélyesedő gyomorcsoportban [7], ami nagyobb reakciókat mutatott. szemfenék, amely eltér a más fajoknál jelentettektől. Ezzel szemben a jelen tanulmány pozitív urázaktivitást mutatott a pylorus antrumok 6% -ában és 0% -ban a mirigy nyálkahártyájában 2 foknál nagyobb vagy azzal egyenlő elváltozásokban. Ez a különbség valószínűleg annak tudható be, hogy Cardona et al. [7]. Ezek az eredmények ösztönzik a specifikusabb vizsgálatokat az e reakciókban részt vevő mikroorganizmusok teljes azonosítására.
Jelen tanulmány nem határozta meg a gyomorelváltozások és az ureázaktivitás közötti összefüggést; Nagyon fontos figyelembe venni, hogy ezek az eredmények kétértelműek, mert az alkalmazott tesztek (PRU és UBT) nem túl érzékenyek a karbamid-agarhoz (arany standard) képest. Ezért nem helyénvaló a „gyors ureáz tesztet” a Helicobacter spp. „Diagnosztikai tesztjeként” említeni. A helyes azonosításhoz, valamint az optimális idő meghatározásához teljes biokémiai és molekuláris profilját kell alátámasztani. a minta összegyűjtése és a karbamidlében történő bevezetés között. Ezenkívül hiányoznak a ló gyomorfelületén található spirálbaktériumok szaporodásának előnyben részesített területeinek meghatározására vonatkozó vizsgálatok a más szerzők által talált és közölt eredmények szerint.
Ureaázaktivitás-kimutatási tesztek a Helicobacter spp. lovaknál kétértelműek, és könnyen zavarhatják őket olyan körülmények, mint a rossz éhgyomri vagy a hasonló biokémiai profilú kommenzális mikroorganizmusok jelenléte, nem szabad őket felhasználni a helikobakteriózis diagnosztizálására, erre a célra célszerű molekuláris diagnózist végezni. Sem lovak gyomornyálkahártyájának fekélyes elváltozásainak előrejelzésére nem használható.
Az Antioquia Egyetem állat-egészségügyi mikrobiológiai laboratóriumához, az Antioquia Egyetem kutatás-fejlesztési bizottságához (CODI) a munkának nyújtott pénzügyi támogatásért, ugyanazon entitás 2013 és 2014 közötti fenntarthatósági stratégiájáért, valamint A COLCIENCIAS fiatal kutatói 2015 programjában.
[1] BAYONA, M.; GUTIÉRREZ, A. Biofilm: Helicobacter pylori túlélési mechanizmus. Rev. U.D.C.A Actualid. & Divulg. Scientif. 16 (2): 335-342. 2013.
[2] BELLI, C.; FERNANDES, W. SILVA, L. Pozitív ureazteszt felnőtt lovaknál gyomorfekély-Helicobacter spp. Archív. Instit.Biolog. 70 (1): 17-20. 2003.
[3] BEZDEKOVA, B.; FUTAS, J. Helicobacter fajok és gyomorfekély lovaknál: klinikai vizsgálat. Állatorvos. Med. 54 (12): 577–582. 2009.
[4] CAMACHO, P. L.; ANDREWS, F.M. Ló gyomorfekély szindróma. In: Robinson, NE; Sprayberry, KA. (Szerk.). Robinson jelenlegi terápiája a lógyógyászatban. 7. kiadás. St. Loius: Elsevier. Pp. 280-284. 2015.
[5] CAMPUZANO, G. Optimalizált 13C-karbamid légzési teszt a H. pylori fertőzés diagnosztizálására. J. Gastroenterol világ. 13 (41): 5454-64. 2007.
[6] CAMPUZANO, G. Helicobacter pylori non-invazív diagnózisa: ¿szerológia, 13 C-karbamid légzési teszt vagy Helicobacter pylori antigének székletben. Med. És Lab. 13 (5-6): 211–231. 2007a.
[7] CARDONA, J.; FALOK, H.; FERNÁNDEZ, H. Helicobacter spp. Meghatározása, Gyomorfekély lovaknál. Tiszteletes MVZ. Cordova. 14 (3): 1831-1839. 2009.
[8] CONTRERAS, M.; MORALES, A.; GARCÍA, M.; DE VERA, M.; BERMÚDEZ, V.; GUENEAU, P. Helicobacter-szerű DNS kimutatása telivér lovak gyomornyálkahártyájában. Lett. Appl. Microbiol. 45 (5): 553–7. 2007.
[9] HEPBURN, R. A Helicobacter jelenlétének vizsgálata a ló gyomrában ureázvizsgálattal és polimeráz láncreakcióval, valamint további vizsgálatok a 13C-karbamid vérvizsgálat lovon történő alkalmazásával kapcsolatban. Leesburg: Virginia Műszaki Intézet és Állami Egyetem. A fokozat tézise. 63-71. 2004.
[10] HUSTED, L.; JENSEN, T.; OLSEN, S.; MØLBAK, L. Lómirigy-gyomor elváltozásainak vizsgálata baktériumok, köztük Helicobacter spp. fluoreszcencia in situ hibridizációval. BMC Microbiol. 19: 10-84. 2010.
[11] MACALLISTER, C.G. ANDREWS, F. M.; DEEGAN, E.; RUOFF, W.; OLOVSON, S.G. A ló gyomorfekélyének pontozási rendszere. Equ. Állatorvos. J. 29 (6): 430-3, 1997.
[12] MOYAERT, H. DECOSTERE, A.; VANDAMME, P.; DEBRUYNE, L.; MAST, J.; BAELE, M.; CEELEN, L.; DUCATELLE, R.; HAESEBROUCK, F. Helicobacter equorumsp. nov., a ló székletéből izolált ureasenegatív Helicobacter fajok. Internat. J. System. Evolut. Microbiol. 57 (Pt 2): 213-8. 2007.