UNIVERSIDAD AGRARIA DE LA HABANA Állatorvostudományi Kar Fructuoso Rodríguez Pérez Ehrlichia canis látszólag egészséges lakóhellyel rendelkező kutyákban és négy nyugat-kubai önkormányzat kullancsában Tézisek az állatorvos-tudomány doktorának tudományos fokozatának lehetőségeként Szerző: DMV Maylín González Navarrete, M. Sc Mayabeque, 2018

canis

UNIVERSIDAD AGRARIA DE LA HABANA Állatorvos-tudományi Kar Fructuoso Rodríguez Pérez Ehrlichia canis látszólag egészséges lakóhelyű kutyákban és négy nyugat-kubai önkormányzat kullancsában Tézisek az állatorvos-tudomány doktorának tudományos fokozatának lehetőségeként Szerző: DMV Maylín González Navarrete, M. Sc oktatók: DMV Adivaldo Henrique Da Fonseca, Dr. C. DMV Eugenio Roque López, Dr. C. Tanácsadók: DMV María Antonia Abeledo García, Dr. C. Lic. Belkis Corona González, Dr. C. Mayabeque, 2018

Elkötelezettség Mindannyiunk számára, akinek megőrzési álma van, hogy megőrizze a természet és az állatok integritásának fenntartását. Mindannyiunknak, aki nem hagyja abba az álmodozást, a harcot, a nyomozást és mindig a legjobb módot keresi önmagunk megőrzésére. Az új generációknak, akiket kötelességünk tisztelni munkánkkal és útmutatásunkkal, minden nap jobban felkészülve, hogy példánk legyen a legjobb módja a tanításnak.

Táblázatindex 1. táblázat: A mintában szereplő települések felületi kiterjedése, népsűrűsége és kutyasűrűsége. 38 2. táblázat A kullancskeverékek mennyisége az egyes települések szakaszai szerint. 41 3. táblázat: Az E. canis beágyazott PCR-rel történő kimutatására használt primerek. 42 4. táblázat: Minden beágyazott PCR vizsgálat amplifikációs ütemezése (Murphy és mtsai., 1998). 5. táblázat: Az E. canis elleni IgG antitesttel rendelkező kutyák százalékos aránya életkor, fajták és nemek szerint. 56 6. táblázat: A minták alapján vett minták és kutyák száma önkormányzat szerint. A mintába vett házak megoszlása ​​a házankénti kutyák száma szerint. 60 7. táblázat: Az összegyűjtött kullancsok és a fertőzött kutyák száma önkormányzat szerint. 65 8. táblázat: A R. sanguineus s.l. fertőzés intenzitásának osztályozása. mintába vett kutyáknál. 70 9. táblázat: A kullancsok általi fertőzés mértéke R. sanguineus s.l. a vizsgált önkormányzatokban. 70 10. táblázat: A változók és a pozitivitás kapcsolata az E. canis-hoz beágyazott PCR-rel Kuba nyugati régiójának négy településén (egyváltozós logisztikai regresszió). 86 11. táblázat: Kuba nyugati régiójának négy településében beágyazott PCR-rel az E. canis iránti pozitivitással kapcsolatos kockázati tényezők. (Többváltozós logisztikai regresszió). 87

100 bp (Promega, Madison, USA); 2. és 3. sor: negatív kontroll; 4-15. Sor: kullancs DNS-keverékek, 16. vonal: pozitív kontroll. 77 15. ábra A mintában vett kutyák százalékos aránya korcsoportonként. 84.

Rövidítések, rövidítések és szimbólumok listája DNS: dezoxiribonukleinsav Ca Cl2: Kalcium-klorid dntps: dezoxiribonukleotid-trifoszfátok EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav ELISAi: indirekt enzimatikus immunszorbens vizsgálat IFI: Indirekt immunfehér fény L: klorid Mg2: milligramm Mg klorid Mg milligramm Mg klorid ml: milliliter mm: millimoláris VAGY: szorzó arány pb: bázispárok PBST: foszfáttal pufferolt sóoldat (pH 7,2-7,4) 5% Tween 20 PBS-sel: foszfáttal pufferolt sóoldat PCR: polimeráz láncreakció ph: hidrogénionos potenciál pmol: pikomol rRNS: riboszomális ribonukleinsav fordulat/perc: fordulatok percenként TAE: Tris-Acetate-EDTA puffer Taq: A Thermus aquaticus U baktériumból izolált DNS-polimeráz enzim: V egység: volt µg: mikrogramm µl: mikroliter µm: mikromoláris 16S rrna: 16S riboszomális RNS: C védjegy: Celsius fokozat

ÁLTALÁNOS MUTATÓ BEVEZETÉS. 2 Hipotézis. 5 Általános cél. 5 Konkrét célok. 5 TUDOMÁNYOS NAGYSÁG ÉS HOZZÁJÁRULÁS. 7 I. FEJEZET BIBLIOGRÁFIAI FELÜLVIZSGÁLAT. 8 1.1. A kutya monocita ehrlichiosisának fogalma és története. 8 1.2. Etiológiai szer. 9 1.2.1. Az E. canis taxonómiája. 10 1.2.2. Morfológia. 10 1.3. A kutyák erlichiosisának epidemiológiája. 11 1.3.1. Az E. canis földrajzi elterjedése. 11 1.3.2. Vektorok. 12 1.3.3. Otthont ad. 19 1.3.4. Az E. canis terjedése. 20 1.3.5. Az E. canis fertőzéssel járó kockázati tényezők. 21 1.4. A kutyák erlichiosisának patogenezise. 23 1.4.1. Klinikai kép. 25 1.5. Az E. canis diagnózisa. 27 1.5.1. Vérkenet diagnosztizálása. 28 1.5.2. Sejtkultúra. 29 1.5.3. Szerológiai diagnózis. 30 1.5.4. Molekuláris diagnózis polimeráz láncreakcióval a gazdaszervezetben. 31 1.5.5. Molekuláris detektálás a vektorban. 32 1.5.6. Megkülönböztető diagnózis. 33 1.5.7. Többszörös fertőzés vagy társfertőzés. 33 1.6. A kutyák erlichiosisának megelőzése és ellenőrzése. 34 1.6.1. Megelőzés. 34 1.6.2. Az R. sanguineus kullancs ellenőrzése. 35 II. FEJEZET. ANYAGOK ÉS ÁLTALÁNOS MÓDSZEREK. 38

4.3.5. A R. sanguineus s.l. által fertőzött kutyákkal rendelkező házak azonosítása 71 4.2.4. Részleges következtetések. 73 V. FEJEZET Ehrlichia canis a vizsgált településeken mintavételezett kutyákból gyűjtött kullancsokban. 75 5.1. Bevezetés. 75 5.2. Anyagok és metódusok. 76 5.2.1. A kullancsok gyűjtése és megőrzése. 76 5.2.2. Beágyazott PCR-vizsgálat. 76 5.2.3. Az amplifikált fragmensek szekvenálása és elemzése. 76 5.3. Eredmények és vita. 76 5.4. Részleges következtetés. VI. FEJEZET Az Ehrlichia canis kockázati tényezői látszólag egészséges kutyáknál, akiknek a lakóhelye Habana del Este, Boyeros, Cotorro és San José de las Lajas önkormányzatok. 81 6.1. Bevezetés. 81 6.2. Anyagok és metódusok. 82 6.2.1. A mintában szereplő populáció jellemzése. 82 6.2.2. Epidemiológiai kérdőív. 82 6.2.3. Statisztikai elemzés. 83 6.3. Eredmények és vita. 83 6.3.1. A mintában szereplő kutyapopuláció jellemzése. 83 6.3.2. A kockázati tényezők elemzése. 85 6.4. Részleges következtetés. 91 VII. FEJEZET. Általános vita. 92 VIII. ÁLTALÁNOS KÖVETKEZTETÉSEK. 98 IX. AJÁNLÁSOK. 100 X. BIBLIOGRÁFIAI HIVATKOZÁSOK. 1 IX. MELLÉKLETEK. 1

Bevezetés 4. Határozza meg az E. canis fertőzés kockázati tényezőit a látszólag egészséges lakóhelyű kutyákban a vizsgált településeken. 6.

Bevezetés TUDOMÁNYOS NAGYSÁG ÉS HOZZÁJÁRULÁS Az E. canis jelenlétét Kubában mutatták ki először látszólag egészséges lakóhelyű kutyák vérmintáiban és kullancsaikban. Az E. canis és az A. platys együttes fertőzését a vérkenet megfigyelése bizonyítja. Ez a kutatás jelentős mértékben hozzájárul a kutyák erlichiosisának epidemiológiájához Kubában, amely lehetővé teszi a döntéshozatalt és a jövőbeni transzdiszciplináris és multiszektorális stratégiák kialakítását a betegség megelőzésére és ellenőrzésére 7

I. fejezet Bibliográfiai áttekintés 1.3.2.1. A R. sanguineus biológiai ciklusa Az R. sanguineus kullancs biológiai ciklusa a trioxén (1. ábra), ezért a kullancsnak három gazdára van szüksége a ciklusának befejezéséhez, minden szakaszban gazdaként szerepel, és az összes molts a környezetben készül (ESCCAP, 2016). 1. ábra A kullancs R. sanguineus, kullancs trioxena biológiai ciklusa (Chávez, 2014) A R. sanguineus kullancs biológiai ciklusának időtartama olyan környezeti tényezőktől függ, mint a hőmérséklet és a páratartalom (Estrada-Peña, 2015). A peték inkubációs periódusa és a lárvák nimfákká, és ezekből felnőttekké történő átalakulása optimális a 25-30 C és a relatív páratartalom közötti tartományban, sokkal szélesebb tartományban (35-95%), miközben meghosszabbodnak, ha a hőmérséklet Alsó. A trópusi éghajlat ideális körülményei között a kullancsok egész évben aktívak maradnak, és egy év alatt három-négy generáció között figyelhetők meg (Dantas-Torres, 2010; León, 2011; Rubio et al., 2015). 14

ÁLTALÁNOS ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Fejezet. Általános anyagok és módszerek II. FEJEZET ANYAGOK ÉS ÁLTALÁNOS MÓDSZEREK 2.1. A vizsgálat típusa és a mintavételezett terület A kutyák erlichiosisának leíró jellegű keresztmetszeti vizsgálatát Havanna tartomány és egy Mayabeque tartomány egyik településén végezték el a 2013 szeptembere és 2014 augusztusa közötti időszakban (1. táblázat). 1. táblázat: A mintában szereplő települések felületi kiterjedése, népsűrűsége és kutyasűrűsége. Havana tartomány Mayabeque önkormányzatok mintavételezett Felület kiterjesztése (km 2) Népsűrűség (lakos/km 2) A kutyák becsült populációja Habana del Este 141,5 1247,3 17649 Szarvasmarha kutya 134,8 1438,6 19392 Cotorro 65,9 1207,7 7959 San José de las Lajas 593,0 125,2 7424 az önkormányzatok számára a hozzáférés egyszerű volt, és lehetőségük volt kapcsolatba lépni a tenyésztőkkel és az állatorvosokkal; azért is, mert Havannai tartomány periférikus települések, nagyobb felszíni kiterjedéssel, valamint városi és vidéki részekkel. San José de las Lajas-t választották a Mayabeque tartomány legnagyobb területű községének (3. ábra). 38

Fejezet. Általános anyagok és módszerek Az E. canis 16S rRNS génjének reprezentatív nukleotidszekvenciáival létrehozott konszenzus szekvenciák, amelyek elérhetőek a GenBank adatbázisban. A mintákat szekvenálásra elküldtük a humán genom és őssejt-kutató központba, a brazíliai São Paulo Egyetem DNS-szekvenáló szektorába. 2.10. Statisztikai elemzés Az adatokat táblázatba foglalták, feldolgozták és ábrázolták a Microsoft Office Excel 2016 programban. Többszörös arányos összehasonlítást végeztek, ehhez a CompaProWin_2.0.1 programot használták, és a korrekcióval végzett Wald összehasonlítási módszert alkalmazták (Castillo és Miranda, 2014). A vizsgálat szempontjából 95% -os konfidenciaszintet vettek figyelembe. Az eredményeket táblázatokban és grafikonokban ábrázoltuk a jobb elemzés és megértés érdekében. 44.

III. Fejezet 6. táblázat: A minták alapján vett minták és kutyák száma településenként. A mintába vett házak megoszlása ​​a házankénti kutyák száma szerint. Önkormányzatok Kutya összesen A mintába felvett házak száma A mintákban szereplő házak megoszlása ​​a házankénti kutyák száma szerint Egyetlen kutya Két-három Több mint három kutya Habana del Este 104 73 54 16 3 Boyeros 102 82 67 11 4 Cotorro 82 49 29 12 8 San José de las Lajas 90 46 29 9 8 Összesen 378 250 179 48 23 A házak 56,40% -ában (141/250) az E. canis pozitív kutyák jelenlétét a beágyazott PCR-teszt segítségével diagnosztizálták. A pozitív kutyákkal rendelkező településekre jutó házak teljes számához viszonyítva a százalékos arányok még ennél is riasztóbb helyzetet mutatnak, kiemelve a legmagasabb értékű Boyeros önkormányzatot (69,51%), jelentősen eltérve a Cotorro és San José településeken talált százalékoktól . las Lajas (10. ábra). 60

III. Fejezet 35/73 (47.94b) 25/46 (54.35ab) 57/82 (69.51a) 24/49 (48.97b) San. José de las Lajas. Cotorro. Boyeros. Kelet-Havanna. A különböző betűk szignifikánsan különböznek egymástól (P 0,05). 10. ábra: A beágyazott PCR-rel diagnosztizált E. canis pozitív kutyákkal rendelkező házak százaléka. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a négy vizsgált önkormányzatból az emberek nagy százaléka él E. canis-ra pozitív kutyákkal, ami riasztást jelent e kórokozó zoonotikus potenciálja miatt (Pérez et al., 2006). Venezuelában Pérez et al. (1996) egy tünetmentes személy vérkultúrájából nyert E. canis izolátumot. Ugyanebben az országban tíz évvel később ennek a rikettsiának a DNS-ét hat emberben amplifikálták monocita ehrlichiosis klinikai tüneteivel (Pérez et al., 2006), újabban pedig az E. canis új genotípusát mutatták ki a bankokban nyert vérmintákban . vér Costa Ricában (Bouza-Mora et al. 2017). 61

III. Fejezet 3.3.5. Részleges következtetések Az E. canis-szal kompatibilis Morulae-t és az A. platys-szal társfertőzést detektáltak, ami növelte a klinikai kép súlyosságát és a fertőző folyamat lehetséges diagnózisát. Az E. canis-szal fertőzött, látszólag egészséges lakóhelyű kutyák nagy százalékát kimutatták e kutyák vérmintáiban, fészkelt PCR-rel. Az önkormányzatonkénti házak magas aránya, ahol a tulajdonosukkal élő E. canis kutyák pozitívak, veszélyt jelentenek az emberek számára a kórokozó fertőzésére. 62

IV. FEJEZET fajok R. sanguineus s.l. néven, amelyek testvérfajainak számát az egész világon még nem határozták meg. Ez a hipotézis arra utal, hogy a kubai R. sanguineus rendszertani állapota felülvizsgálatot igényelhet (Gray és mtsai, 2013; Dantas-Torres és Otranto, 2015; Nava és mtsai, 2015) a karibi szigeteken, mint például Granada, Trinidad, St. Kitts és Nevis, Martinique, Aruba, Puerto Rico és Haiti arról számolt be, hogy e kullancsfaj gyakran megjelenik kutyákban (Yabsley et al., 2008; Asgarali et al., 2012; Kelly et al., 2013; Loftis et al. és mtsai., 2013; Starkey és mtsai, 2016). A B C D 11. ábra: A kullancs morfológiája R. sanguineus s.l. Férfi ventrális (A) és háti (B) nézet. Női hasi (C) és háti (D) nézet. 66

IV. FEJEZET 160 140 120 100 80 60 40 20 0 95 84 48 44 48 23 8 158 153 47 16 24 14 16 2 0 0 9 0 Imago hím Imago nőstény nimfák Lárvák Összesen Habana del Este Boyeros Cotorro San José de las Lajas 73 12. ábra Az R. sanguineus sl kullancsok szakaszainak és nemének százaléka fertőzött kutyáknál. A túlsúlyban lévő hím imago volt, amelyet a női imago követett, a legkisebb érték a lárva stádium volt. Hasonló viselkedés mutatkozott a négy vizsgált településen. Az eredmények összefüggésben lehetnek a kullancsok gazdaszervezetből való kihullásának sebességével és a mintavételezés időpontjával, ahol a R. sanguineus faj lárvái főleg napközben vetési mintázatot mutatnak. Ezzel szemben a nimfák és a gravid nőstények főleg éjszaka hullanak (Dantas-Torres, 2010). Az a tény, hogy a férfi imago stádium dominált a többi szakaszban, releváns, mivel fontos szerepet játszik az E. canis átvitelében. Bremer és mtsai. (2005) kimutatta, hogy a hímek többször is táplálkozhatnak a nőstény kullancs hiányában, és ebben a folyamatban megszerezhetik és továbbadhatják az E. canis-t. 68

IV. FEJEZET A kutyák kullancsprevalencia-értékei változhatnak a kutyák populációs sűrűségétől, az ektoparazicidekkel vagy kullancsok elleni riasztószerekkel kezelt kutyák arányától, valamint az olyan egyedi tényezőktől függően, mint az állat fajtája, kora és életstílusa. A Boyeros javára vizsgált településeken előforduló fertőzések mértékének változékonysága összefüggésbe hozható gazdáik életmódjával, ahol a kutyák 52% -át laza vagy félig zárva Ellenőrzés vagy időbeli korlátozás nélkül ez kedvez a más kutyákkal való érintkezésnek és a kullancsoknak való kitettségnek (Azevedo et al., 2011; Cardoso et al., 2012). Ebben a községben a kutyák 66,70% -a (66/102) a 2 és> 10 éves kategóriába tartozott, közülük 57,57% (38/66) volt kullancs fertőzött, míg 35, 29% (36/102) kategóriában