1 Élelmiszer- és Fejlesztési Kutatóközpont, A.C. A SARDINA MONTEREY (Sardinops sagax caerulea) TÖMEGÉBŐL SZÁRMAZÓ SAVPROTÉZEK IMMOBILIZÁLÁSA A CHITIN ÉS CITOSÁN ALAPJÁN TÁMOGATÓKBAN: Jesús Aarón Salazar Leyva AZ ÉLELMISZER-TECHNOLÓGIAI KOORDINÁCIÓBAL HASZNÁLT TÉZISEK A DOCTOR

fejlesztési

6 DEDIKÁCIÓ Szüleimnek: Manuel Salazar Chávez (Q.E.P.D.) és María del Rosario Leyva Solorzano. Nagyszerű életpéldája arra tanított, hogy mindig többet tegyek testvéreimhez: Carloshoz, Marisolhoz és Charishoz. Valamilyen módon mindannyian befolyásolták és inspirálták, hogy elérjem céljaimat és továbblépjek. Köszönöm testvérek. A nőimnek: Idalia, Camila és Sofía. Ők a motorom és a legnagyobb inspirációm. Szeretem őket. látta

7 TARTALOM Oldal összefoglaló. 1 I. FEJEZET A vizsgált téma korszerű állapotának áttekintése 17 II. FEJEZET. A Monterey szardínia gyomrából (Sardinops sagax caerulea) izolált savas proteázokból, valamint garnélarák fejéből nyert kitin és kitozán alapú hordozókból (Penaeus spp.) Álló immobilizált biokatalitikus rendszer kialakítása 40 III. FEJEZET. A Monterey szardínsav proteázok (Sardinops sagax caerulea) optimális immobilizációs körülményeinek elérése részben dezacetilezett kitin hordozókon. 52 IV. FEJEZET. Részben dezacetilezett kitinben immobilizált Monterey szardínsav-proteázok (Sardinops sagax caerulea) biokémiai és működési jellemzése 79 ÁLTALÁNOS KÖVETKEZTETÉSEK ÉS KUTATÁSI TÁMOGATÁSOK MEGJEGYZÉS: Az I. és II. vii

17 felhasználásával olyan biokatalitikus rendszert terveztek, amely Monterey szardínia gyomrából (Sardinops sagax caerulea) izolált savproteázokból áll, immobilizálva a garnélarák fejéből nyert kitin és kitozán alapú hordozókon (Penaeus spp.). 7

24 Globális ipari enzimek piaci jelentése: 2013. évi kiadás. Goycoolea, F., Agulló, E., & Mato, R. (2004). Források és beszerzési folyamatok. In: A. Abram Pastor, Kitin és Kitozán: beszerzés, jellemzés és alkalmazások Peru: A Perui Pápai Katolikus Egyetem szerkesztőségi alapja. (P. ^ Pp Gupta, R., Beg, Q., & Lorenz, P. (2002) Baktériumos lúgos proteázok: molekuláris megközelítések és ipari alkalmazások. Alkalmazott mikrobiológia és biotechnológia, 59 (1), Haard, NF (1992). A tengeri élőlények proteotitikus enzimjeinek áttekintése és alkalmazásuk az élelmiszeriparban. Journal of Aquatic Food Product Technology, 1 (1), He, S., Franco, C., & Zhang, W. (2013). Funkciók, alkalmazások és fehérjehidrolizátumok előállítása a halfeldolgozási melléktermékekből (FPCP). Food Research International, 50 ( Honarkar, H., & Barikani, M. (2009). Biopolimerek alkalmazása I: kitozán. Monatshefte für Chemie-Chemical Monthly, 140 (12), Janec ek, S. t. (1993). Stratégiák a stabil enzimek. Process Biochemistry, 28 (7), Khor, E., & Lim, LY (2003). A kitin és a kitozán beültethető alkalmazásai. Biomaterials, 24 ( 13), Kurita, K. (2006). Kitin és kitozán: funkcionális biopolimerek tengeri rákokból. Tengeri biotechnológia, 8 (3),

26 Rustad, T. (2003). Tengeri termékek hasznosítása termékekkel. Electronic Journal of Enviromental, Agricultural and Food Chemistry (2). Rustad, T., Storrø, I., & Slizyte, R. (2011). A tengeri melléktermékek hasznosításának lehetőségei. International Journal of Food Science & Technology, 46 (10), Shahidi, F. és Janak Kamil, Y. (2001). Halakból és vízi gerinctelenekből származó enzimek és alkalmazásuk az élelmiszeriparban. Trendek az élelmiszer-tudományban és technológiában, 12 (12), Sila, A., Nasri, R., Bougatef, A., & Nasri, M. (2012). Emésztőrendszeri alkáli proteázok a gobyból (Zosterisessor ophiocephalus): Jellemzés és lehetséges alkalmazás detergens adalékanyagként és garnélarák hulladékok fehérjementesítésében. Journal of Aquatic Food Product Technology, 21 (2), Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., & Lee, J.-K. (2013). A fehérjetechnikától az immobilizációig: ígéretes stratégiák az ipari enzimek frissítésére. International Journal of Molecular Sciences, 14 (1), Turk, B. (2006). A proteázok célzása: sikerek, kudarcok és jövőbeli kilátások. Természeti vélemények Kábítószer-felfedezés, 5 (9),

I. FEJEZET Kitin és kitozán alapú anyagok felhasználása a proteázok immobilizálásában: hatásuk stabilizálódásukra és alkalmazásukra A Mexikói Vegyészmérnöki Lapban közzétételre elfogadott cikk 17

30 Salazar-Leyva és mtsai./Mexican Journal of Chemical Engineering 13. évf., 1. sz. (2014) xxx-xxx 1. ábra. A ma leginkább használt enzimimobilizációs módszerek. Idővel különböző módszereket dolgoztak ki az enzimek immobilizálására. Fontos azonban megemlíteni, hogy nincs univerzális immobilizációs rendszer, mivel egy adott esetben több módszert kell értékelni, az immobilizálandó enzimtől és a katalitikus rendszer alkalmazásának folyamatától függően. Annak ellenére, hogy a különböző immobilizációs folyamatok fogalmilag eltérnek, elmondható, hogy gyakran 3

II. FEJEZET Monterey szardínia (Sardinops sagax caerulea) savtartalmú proteázai, amelyek immobilizálva vannak garnélarák hulladék kitin és kitozán hordozókon: Melléktermék katalitikus rendszer keresése Az Applied Biochemistry and Biotechnology folyóiratban megjelent cikk 40

56 800 Appl Biochem Biotechnol (2013) 171: Jelentős különbségeket állapítottunk meg a P 57 Appl Biochem Biotechnol (2013) 171: MWM Pepsin II 1. ábra Enzimkivonat SDS-PAGE. 1. vonal, molekulatömeg-markerek (MWM). A 2. vonal, félig tisztított savas proteáz kivonat a szardínia Monterey gyomrából. Fehérje adszorpció támaszokon A PA-val kapcsolatban minden vizsgálat 65% -nál nagyobb értékeket mutatott. A maximális% -ot CHSF-re és% -ot PDCHNF-immobilizációs hordozókra, amelyek 0,2% genipinnel aktiváltak (kovalens immobilizáció) figyeltek meg (P 0,05) (2. táblázat). Az irodalom szerint elfogadhatók voltak a fehérje adszorpciós képességei a jelen vizsgálatban használt különböző hordozók segítségével. Egy korábbi tanulmány arról számolt be, hogy a GA-val térhálósított kitozángyöngyök az elérhető proteáz 72% -át adszorbeálták [26]. Eközben, amikor a papaint GA-val aktivált kitozán-hidrogélekhez kapcsolták, az enzimadszorpciónak csak 15,3% -át sikerült elérni [27]. Más vizsgálatok alacsonyabb fehérjeadszorpciós értékeket jelentettek (35%), amikor a Candida rugosa lipázt immobilizálták 0,3% (p/v) 120 enzimaktivitással aktivált kitozángyöngyökön ph 2. ábra A ph hatása az enzimaktivitásra Monterey szardínia (S. sagax caerulea) félig tisztított savas proteáz kivonata

62 III. FEJEZET Monterey szardínia (Sardinops sagax caeurelea) savas proteázainak optimális immobilizálása garnélafej hulladékból származó, részben dezacetilezett kitinre Kézirat készült a Journal of Aquatic and Food Product Technology számára 52

63 Monterey szardínia (Sardinops sagax caeurelea) savas proteázainak optimális immobilizálása garnélarák-fej hulladékból részben dezacetilezett kitinre Futófej: Az optimalizálás immobilizálásával a szardínák proteázai Jesus Aaron Salazar-Leyva a, Jaime Lizardi-Mendoza a, Juan Carlos Ramirez-Suarez a, Elisa Miriam Valenzuela-Soto a, Josafat Marina Ezquerra-Brauer b, Francisco Javier Castillo-Yañez b és Ramon Pacheco-Aguilar a * Élelmiszer- és Fejlesztési Kutatóközpont AC Carretera a la Victoria, C. Hermosillo, Sonora, Mexikó. b Élelmiszeripari Kutatási és Posztgraduális Tanszék, Sonorai Egyetem. Rosales y Niños Héroes S/N. Hermosillo, Sonora, Mexikó. * Levelező szerző: Ramon Pacheco-Aguilar Tel./Fax: cím: 53

81 Tharanathan, R. és Kittur, F Kitin - a vitathatatlan nagy potenciállal rendelkező biomolekula. Crit. Élelmiszer-tudomány Nutr. 43: Tripathi, P. Kumari, A. Rath, P. és Kayastha, A. M α-amiláz immobilizálása mung babból (Vigna radiata) Amberlite MB 150 és kitozán gyöngyökön: Összehasonlító tanulmány. J. Mol. Katalin. B-Enzym. 49:

82 1. táblázat: A központi kompozit tervezésnél alkalmazott értékelt tényezők, kódolt és tényleges értékek Faktor Magas axiális (+ α) Magas faktoriális (+1) Központ (0) Alacsony faktoriális (-1) Alacsony axiális enzimterhelés, mg/ml (X1) Immobilizáció ph (X2) STPP,% (X3) (-α) 72

83 2. táblázat Savanyú proteázok izolálása a Monterey szardínia (Sardinops sagax caerulea) gyomrából Izolációs lépés Összes fehérje (mg) Összes aktivitás (U) a Specifikus aktivitás (U/mg) A tisztaság növekedése Nyers kivonat (NH 4) 2 SO 4 20% (NH 4) 2 SO 4 70% dializált kivonat, U = 1 μg tirozin ekvivalens, hemoglobinból felszabadulva percenként 73

84 3. táblázat A garnélarák-fej hulladék és az extrahált kitin kémiai összetétele (szárazanyagra vonatkoztatva) Minta lipidek Összes hamu fehérje Kitin-nitrogén Garnélarák 4,3 ± ± ± ± ± 0,1 hulladék Kitin 0,56 ± ± ± ±

85 4. táblázat Az értékelt válasz tervezési mátrixa és kísérleti értékei Futtatási tényezők válasz Enzimterhelés, mg/ml (X 1) Immobilizációs ph (X 2) STPP,% (X 3) Immobilizációs hozam (%)

86 Immobilizációs hozam (%) Enzimterhelés (mg/ml) immobilizációs hozam (%) Immobilizáció ph b Immobilizációs hozam (%) STPP (%) c 1. ábra. Különböző paraméterek hatása a szardínia-proteázok immobilizációs hozamára (a) Enzimterhelés b) immobilizációs ph és c) nátrium-tripolifoszfát (STPP) koncentrációja 76

87 5. táblázat: A beépített másodfokú modell varianciaanalízise (ANOVA) az immobilizációs hozam optimalizálásához Forrás Szabadság mértéke F-érték P-érték (Prob> F) Modell * Enzimterhelés, mg/ml (X 1) * Immobilizáció ph ( X 2) STPP,% (X 3) X 1 * XX 1 * XX 1 * XX 2 * X * X 3 * X Az illeszkedés hiánya RR 2 adj 0,71 * Jelentős P értéknél kisebb

88 a b c 2. ábra. Válaszfelületi ábrák az immobilizációs körülmények kölcsönhatásairól az immobilizációs hozamra. a) enzimterhelés és immobilizáció ph, b) enzimterhelés és tripolifoszfát koncentráció, c) immobilizációs ph és tripolifoszfát koncentráció 78