Összegzés

A bal rágcsáló pneumonectomia értékes technika a pulmonalis hipertónia vizsgálatában. Itt bemutatunk egy protokollt a patkány pneumonectomia eljárásának és a posztoperatív ellátásnak a minimális morbiditás és mortalitás leírására.

monokrotalinnal

Absztrakt

Bevezetés

A pulmonalis artériás hipertónia (PAH) egy progresszív és halálos kimenetelű betegség, amelyet fokozott pulmonális véráramlás, megnövekedett érellenállás, gyulladás és a kis pulmonalis erek átalakulása jellemez. Ez az átalakítás általában vaszkuláris elváltozásokat eredményez, amelyek elzárják és kitörlik a kis tüdőartériákat, érszűkületet és a jobb kamra megnövekedett utóterhelését okozva. A PAH-nak van néhány sikeres farmakológiai kezelése; ennek következtében a PAH továbbra is magas mortalitással rendelkezik. A közelmúltban a pulmonalis hipertónia patobiológiájának kutatási fókusza egy olyan mechanizmus felé mozdult el, amelyben a fokozott pulmonális véráramlás szerepét a pulmonalis vaszkuláris angio-proliferáció átalakításának fontos kiváltó tényezőjének tekintik 3, 4 .

A kézirat újdonságát a patkányok baloldali pneumonectomiájának nagyon részletes és teljes műtéti protokollja, valamint e modellek technikai és fiziológiai kihívásainak tárgyalása mutatja be. Mivel ez a protokoll jelenleg nem áll rendelkezésre, sok kutató úgy véli, hogy a modell túl nehéz. Azok a kutatók, akik bal pneumonectomiát végeztek, magas halálozási és morbiditási rátával szembesülnek, szükségtelen állatok elvesztésével járva, veszélyeztetve a tudományos értékelést. Ehelyett sokan olyan klasszikus modelleket alkalmaznak, mint az MCT injekció, a krónikus hipoxia vagy a pneumonectomia a PAH létrehozására. Ezek a modellek azonban sokkal kevésbé hatékonyak, mint az MCT vagy a Sugen és a bal pneumonectomia kombinációja. A cikk fő célja az első részletes és reprodukálható műtéti protokoll kidolgozása patkányok egyoldalú baloldali pneumonectomiájához és a PAH legjobb műtéti modelljének biztosítása. A baloldali egyoldalú pneumonectomia protokolljának MCT-vel vagy SU5416-tal történő kombinálása lehetővé teszi a kutatók számára, hogy egy sokkal hatékonyabb és klinikailag relevánsabb súlyos PAH-modellt hozzanak létre e halálos betegség patogenezisének tanulmányozásához.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az alábbiakban ismertetett eljárásokat a Sínai-hegység Icahn Orvostudományi Iskolájának intézményi állatgondozási és -használati bizottsága (IACUC) hagyta jóvá. Minden humánus gondozásban részesült patkány megfelel a Sínai-hegy "Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához" című dokumentumnak.

1. felkészülés a műtétre

  1. Cooley-Mayo autokláv ívelt olló (nagy olló), egyenes Iris olló (kicsi olló), Vannas McPherson írisz olló (hátsó olló), Wangensteen szövetcsipesz (atraumatikus csipesz), Gerald szövet csipesz, sima huzal tüske (önmegőrző visszahúzó), kishajó-cauterizer, gézpárnák, kettős szonda, finom vaszkuláris tűtartó és Jacobson Micro szúnyog vérzéscsillapító csipesz (szúnyog).

2. patkányok előkészítése és intubálása

3. steril környezet előkészítése

  1. Vizualizálja a műtéti területet a mikroszkóp alatt. Ezt először meg kell tenni, mert a mikroszkóp nem állítható be, ha a környezet steril.
  2. Vegyen fel steril sebészeti kesztyűt. Ne érintse meg a steril eszközöket, a sebészeti kendőket és a patkány testének műtéti területét!.
  3. Helyezzen steril kendőt a patkány testére és a műszer tálcára, hogy steril környezetet teremtsen.
  4. Steril kesztyűt viselve helyezzen steril műszereket a steril műszertálcára.

4. Bal műtéti eljárás Pneumonectomia

5. posztoperatív gyógyulás

  1. Helyezze az állatot szegycsontba. Kapcsolja ki az izofluránt, de továbbra is adjon oxigént a patkánynak az endotracheális csövön keresztül. Soha ne hagyja az állatot felügyelet nélkül, amíg nem kapott elegendő tudatot a járáshoz, és az állatot a ketrecében.
  2. Adjon szubkután 2-3 ml steril, melegített Ringer-oldatot.
  3. Figyelje a pulzusszámot (≈200 - 500 ütés/perc), az oxigéntelítettséget (≥95%) és az állati színt annak megerősítésére, hogy az állat jól lélegzik.
  4. Amikor az állat spontán légzési és nyaki mozgásokat kezd végrehajtani, és reagál a fizikai ingerekre (például a szemek tágra nyílása, az orr és a fül mozgása a hangra reagálva), a csövet kihúzva extrudálja az állatot, és válassza le a ventilátort.
  5. Helyezze vissza az állatokat egy üres ketrecbe, más állatok társaságában. Az állatnak legalább 3 napig egyedül kell lennie.
  6. A fájdalom visszaszorítására adjon 0,1 mg/kg buprenorfint szubkután 12 óránként 3 napig.

6. "Second Strike" MCT vagy Sugen adminisztráció

  1. Adjon be 1 ml MCT-t (60 mg/kg) vagy 1 ml cukrot (25 mg/kg) szubkután, egy héttel a műtét után.

7. betakarítási terminál

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Az elfogadott osztályozási rendszer szerint a pulmonalis hipertóniát az átlagos pulmonalis artéria nyomás (MAPP) jellemzi, amely meghaladja a normális pulmonalis artéria nyomás felső határát (azaz 25 Hgmm). A pneumonectomia + MCT csoportban súlyos PAH alakult ki a 21. napra magasabb PAPM mellett (1. ábra). Az mPAP kiszámítása a következő képlettel történik:

A szisztolés és a diasztolés nyomást, az RV-t és a PA-t, és az előnyös fotovoltaikus telepítéshez kapcsolódó fő pulmonális artériában lévő nyomáskatéterrel mértük. Az átlagos pulmonalis artériás nyomást (PAPM) a fenti képlet segítségével számítottuk ki. A kontroll csoportban (n = 20) az átlagos BP nyomás 18,6 ± 1,76 Hgmm volt (1. ábra). A pneumonectomia + MCT csoportban (n = 30) a PAPM 2,25-szer nagyobb mértékben nőtt a kontroll csoporthoz képest (41,9 ± 2,89 Hgmm) (1. ábra). A Sugen + pneumonectomia csoportban (n = 30) a PAPM háromszor magasabb volt, mint a kontroll csoportban (53 ± 6,60 Hgmm). Az MCT és a Sugen csoportokban az RVSP jóval magasabb volt a kontroll csoporthoz képest (1. ábra)).

A patkány tüdőszövet hisztopatológiáját hematoxilinnal és eozinnal végeztük, majd ezt optikai fénymikroszkóppal végeztük. A normál tüdőben van hely az alveolusok között, és az alveoláris struktúrák nyilvánvalóak. Az edények tisztaek és normál vastagságúak (2A. Ábra). A PAH tüdőben van bizonyíték az átalakításra, az érfal megvastagodására, az érek súlyos összehúzódására és a fokális tüdőartériára (2B. Ábra), C).


1. ábra: súlyos pulmonalis artériás magas vérnyomás bal tüdőműtétben MCT modellel kombinálva. Jelentős különbségek a PAPM és az RVSP között a kontrollcsoport és az MCT csoport pneumonectomia, valamint a kontrollcsoport és a Pneumonectomy + Sugen csoport között. Az adatokat átlagos SEM-ként mutatjuk be. A p értékeket post-hoc ANOVA és egyirányú Tukey teszt alkalmazásával számoltuk. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


2. ábra: A tüdőszövet H & E festésének reprezentatív fotográfiái. (NAK NEK) Normál tüdőszövet. A normál patkány tüdőben az artériák (piros nyíl) nyitottak, az érfalak pedig normál méretűek. (B) Pneumonectomiával és MCT-vel kezelt pulmonalis artériás hipertónia patkányainak patológiai vaszkuláris átalakulása. A tüdő fokális tüdőartériát és gyulladást mutat, az érfal koncentrikus mediális megvastagodása (fehér nyíl) és az érfal koncentrikus intim vastagodása (fekete nyíl), ami erősen keskeny ereket eredményez. (C) Kóros vaszkuláris átalakulás Pneumonectomiával és Sugennel kezelt PAH patkányokban. A tüdő emellett fokális tüdőartériát és gyulladást is mutat, az érfal koncentrikus mediális megvastagodása (fehér nyíl) és az érfal koncentrikus intim megvastagodása (fekete nyíl). Ezen erek lumenje erősen korlátozott vagy teljesen zárt. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Amint azt fentebb jeleztük, más PAH-modellekben a patkányokban nem alakul ki kisérerek vaszkuláris obliterációja, neointimális és plexiform elváltozások, valamint magas PA és RV nyomás. Megállapították, hogy a krónikus hipoxia PAH-modelljével végzett kezelés megvastagodott az ereken, de az erek nyitottak maradnak, nincs obliteratív érelváltozás és kevés gyulladás 5. Az RVSP és mPAP értékek kissé megemelkedtek az 5. kontrollhoz képest. Hasonlóképpen, az MCT-vel vagy a pneumonectomiával végzett kezelés pulmonalis artériás nyomást eredményezett, amely nem volt szignifikánsan magasabb, mint a kontroll patkányok és kissé átalakult erek 7, 9 .

Ezzel szemben a bal pneumonectomia MCT-vel vagy Sugennel kombinálva hatékony modellnek bizonyult a súlyos PAH kialakításában. A kontroll csoporthoz képest az átlagos pulmonális artériás nyomás (PAPM) és a jobb kamrai szisztolés nyomás (RVSP) a súlyos PAH-ban szenvedő patkányokban csaknem megduplázódott (1. ábra). Ezenkívül ezeknél a patkányoknál plexiform elváltozások, koncentrikus mediális és intim megvastagodás, disztális kis tüdőartériák thromboemboliás obstrukciója, valamint nagyon magas pulmonalis artéria és jobb kamrai nyomás alakult ki (2. ábra) ). Krónikus hipoxiával, az MCT injekcióval és a PAH pneumonectomiával csak más modellekben szembesülnek, az MCT vagy Sugen modellel kombinált pneumonectomia klinikailag releváns állapotot hoz létre. Ráadásul ennek a modellnek - ha helyesen hajtják végre - az intraoperatív halálozási aránya közel 0%, a jobb tüdő hiányából pedig a légzési elégtelenség kompenzálására csak 10% -os a halálozási arány. Az intraoperatív vagy a gyógyulás utáni magasabb halálozási arány általában emberi vagy felszerelési hibát jelez.

A bal pneumonectomia sikeres végrehajtásához és a PAH létrehozásához ebben a protokollban számos kritikus lépést kell végrehajtani. Először is nagyon fontos figyelemmel kísérni az állat oxigéntelítettségét, capnográfiáját és a pulzusszámlálást az egész eljárás során, hogy biztosítsuk az állat lélegzését és szívdobbanását. Az oxigéntelítettség monitorozása tovább erősíti a helyes intubációt. Az eljáráshoz feltétlenül szükséges az állat intubálása. Amikor az állat mellkasüregét kinyitják, a mellkasüregben általában fennálló negatív nyomás pozitív légköri nyomásra változik. Tehát a patkányoknak mesterséges lélegeztetéssel pozitív nyomásra van szükségük. Megfelelő intubálás nélkül az állat tüdeje összeomlik a pozitív légköri nyomástól.

Végül a gyógyulás az egyik legkritikusabb lépés a patkány pneumonectomia után. A thoracotomia nagyon fájdalmas műtét, és a fájdalomcsillapítók elengedhetetlenek a megfelelő szellőzés elősegítéséhez, a műtét utáni időszakban a tüdő kirándulások javításához és a fájdalom csökkentéséhez. A patkányoknak szegycsontban kell helyreállniuk a tüdőinfláció maximalizálása érdekében. 10 perc elteltével a kutató csökkentheti a szellőzés sebességét, hogy ösztönözze az állatot arra, hogy önállóan lélegezzen és felébredjen. Ha az állat cianotikussá válik, és oxigéntelítettségi szintje csökken, meg kell növelni az oxigént, a szellőztetési sebességet, és a térfogatot legalább 5 ml-re kell növelni, a ventilátor kapacitásától függően. A patkányok extrudálását a lehető legkésőbb kell elvégezni, amint az állat teljesen ébren van. A kutató az extubált patkányt egy oxigénáramlású kamrába helyezheti a nagyobb gyógyulást.

Ha a technikát helyesen hajtják végre, és a fenti szempontokat figyelembe veszik, akkor kombinált baloldali egyoldalú pneumonectomia elvégzése MCT-vel vagy Sugennel megbízható modellt hoz létre a súlyos PAH-ból, mint önmagában a hipoxia, az MCT vagy más módszerek. A pneumonectomiát helyesen hajtják végre, az állat életben marad, az eljárás rövid (15-30 perc), és a vizsgálónak nincs szüksége specifikus érsebészeti képességekre. Ezenkívül a kutató képes sikeresen létrehozni a PAH-t. Ennek a módszernek az a korlátja, hogy a thoracotomia invazív eljárás, endotrachealis intubációra van szükség, és a kutatónak szüksége van néhány általános sebészeti készségre. Neointimális pulmonalis vaszkuláris okklúziós elváltozások és a pulmonalis artéria nyomásának kifejezett emelkedése, hasonlóan az emberi pulmonalis hipertóniás betegekhez, patkányokban nyilvánvaló a pneumonectomia kombinációja után MCT vagy SU5416 injekcióval 7, 8, 9. a jelenlegi modell megbízható módszer a pulmonalis túlcsordulás szerepének tanulmányozására az ellenoldali tüdőben és az áramlás okozta pulmonalis hipertóniában.

Ez a protokoll hasznos lehet más betegségek tanulmányozásában. Ez a modell felhasználható a kontralaterális tüdőben a tüdőszövet kompenzációs növekedésének tanulmányozására. Ez a technika a jobb kamrai elégtelenség (RVF) kezelésének tanulmányozására és fejlesztésére is használható. A jobb kamra súlyos hipertrófiája alakul ki azoknál az állatoknál, akiknél fokozott vérnyomás mellett neointimalis elváltozások alakulnak ki 7. Az RVF a PAH-betegek kb. 70% -ában halált okoz 13. A pulmonalis véráramlás növelése hasznos lehet veleszületett szívbetegségekben szenvedő betegek kezelésének tanulmányozásában és fejlesztésében is.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

A szerzőknek nincsenek potenciális összeférhetetlenségeik.