AZ AFLATOXIN B1 ÉS AZ OCRATOXIN A KOMBINÁLT TOXIKUSSÁGÁNAK VIZSGÁLATA IN VITROBAN ÉS IN VIVO MODELLEKBEN AZ AFLATOXIN B1 ÉS AZ OCHRATOXIN A TOXICITÁSÁNAK VIZSGÁLT IN VITROBAN ÉS VIVO MODELLJEKBEN Laura Ana Corcuera Martínes DOKTOR

toxikusságának

Az AFLATOXIN B1 ÉS AZ OCRATOXIN A KOMBINÁLT TOXICITÁSÁNAK VIZSGÁLATA IN VITROBAN ÉS IN VIVO AZ AFLATOXIN B1 ÉS OCHRATOXIN A IN VITRO ÉS VIVO MODELLEK ÖSSZETETT TOXICITÁSÁNAK MINTÁI a Navarrai Egyetemet az Élelmiszertudományi, Élettani és Toxikológiai Tanszéken Dr. Adela López de Cerain Salsamendi és Dr. Elena González-Peñas Pamplona vezetésével, 2012. április Dra. Adela López de Cerain Salsamendi Dra. Elena González-Peñas

Ezt a munkát a következő projektek finanszírozták: Mikotoxinok: az ochratoxin A és az aflatoxin B1 kombinált kezelésének toxicitása in vitro és in vivo modellekben Spanyol Kormány Tudományos és Innovációs Minisztériuma Hivatkozás: AGL2008-01437/ALI A toxinok jelenléte a élelmiszer és szerepvállalása az emberi egészségben CAN Alapítvány Hivatkozás: 10829

A családomnak Pamplonából (Begoña), Miguel, Lander, Javier, Jose, Asier, Txikitin, María, Manolo. amiért ennyire szeretettel fogadtam és otthon éreztem magam. Ibannak, hogy minden lépést velem tett ezen az úton, felállt, amikor leesem, és a türelmét. Köszönöm, hogy ennyire szeretsz és olyan jól megértesz. Ez a tézis is a tiéd, és a jövő a miénk. A családomnak, hogy törődik velem. Ama, nagyi és nagypapa, akik látták a kezdetet és az égből, látják a végét. Al Yayo, aki élvezheti ezt a diadalt velem. Ignacio és Begoña nagybátyáimnak, Maríának. Luis bátyámnak köszönöm a biztatást, a kíváncsiságot és a rajongást, arra késztet, hogy minden nap jobb legyek. Semmi sem lett volna lehetséges szüleim, életem oszlopai nélkül. Köszönöm, hogy megtanítottad, hogy a jól végzett munka maga a siker. Köszönöm a szeretetét, hogy hitt bennem, és tudatta velem, hogy tudok. Ez a te nyereményed is. KÖSZÖNET MINDENKINEK! 9.

A szüleim A Iban Azért kapták, mert nem tudták, hogy ez lehetetlen Jean Cocteau

Rövidítések/rövidítések RÖVIDÍTÉSEK/RÖVIDÍTÉSEK 3-ADON: 3-acetildeoxinivalenol/3-acetildeoxynivalenol 8-oxo-dG: 8-oxoguanine/8-oxoguanine 15-ADON: 15-acetildeoxynivalenol/15-acetyldeoxynivalenol/15-acetyldeoxynivalenol1-Fotel1Ben111Benden1Fotel1Ben1Ben111Bend1Ben11Fen11Ben1Ben11Benten1Bet1Ben1Ben11Fen1Ben1Ben1Ben1Bent1Ben1Fen11Ben1Ben1Bent1Ben1Ben1Fen1Ben1Ben1Fen1Ben1Ben1Bent1Fen1Ben1BenFen1Ben1Ben1: F1/AFB1-formamidopirimidin AFB2: Aflatoxin B2/Aflatoxin B2 AFBO: AFB1-exo-8,9-epoxid/AFB1-exo-8,9-epoxid AFG1: Aflatoxin G1/Aflatoxin G1 AFG2: Aflatoxin G1 AFG2: Aflatoxin G1 AFG2: Spanyol Ipari Gyógyszerészeti Szövetség AOAC: Nemzetközi Analitikai Kémikusok Szövetsége/Hivatalos Analitikai Kémikusok Szövetsége AP hely: Apirimidin vagy apurinic hely AU: Önkényes egységek testtömeg: Testtömeg CIT: Citrinina/Citrinin CV: Variációs koefficiens DCFH-DA: Dihidrodiklórfluoreszcein-diacetát/Dihidrodiklór-fluoreszcein-diacetát DL 50: Halálos adag 50 DON: Deoxinivalenol/Deoxynivalenol DTI: Napi tolerálható bevitel EC: Európai Bizottság/Európai Bizottság EFSA: Európai Biztonsági Hatóság Alimentaria/Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság 13

Rövidítések/rövidítések OECD: Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet/Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet OTA: Ochratoxin A/Ochratoxin A PBS: Foszfátpuffer/Foszfátpufferolt sóoldat pc: Testtömeg PECE: Polifenollal dúsított kakaó kivonat/polifenol dúsított kakaókivonat pk a: Sav disszociációs állandó RE: Viszonylagos hiba SCF: Az Európai Bizottság Élelmiszerügyi Tudományos Bizottsága/Élelmiszerügyi Tudományos Bizottság SCOOP: Tudományos együttműködés élelmiszer-kérdésekben/Tudományos együttműködés az élelmiszerekkel kapcsolatos kérdésekben) RF: Relatív fluoreszcencia ROS: Reaktív oxigénfajok/Reaktív oxigénfajok RSD: Standard deviáció/Relatív standard deviáció SE: Standard hiba t 1/2: eliminációs felezési idő/eliminációs felezési idő T-2: Toxin T-2/T-2 toxin TWI: tolerálható heti bevitel UA: Önkényes egységek UHPLC-LD: Ultra magas folyadékkromatográfia oldat ultraibolya detektorral/Ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-fluoreszcencia detektor UV: Ultraibolya detektor WHO: Egészségügyi Világszervezet/Egészségügyi Világszervezet ZEA: Zearalenone/Zearalenone 15

TARTALOM/TARTALOM 1. fejezet/1. fejezet Általános/általános bevezetés Bevezetés 17 2. fejezet Célok, célkitűzések és vázlat 55 3. fejezet Az okratoxin A csökkenti az üstökösvizsgálattal kimutatott aflatoxin B1 által kiváltott DNS-károsodást a Hep G2 sejtekben 61 4. fejezet A polifenollal dúsított kakaó kivonat csökkenti a mikotoxinok által termelt szabad gyököket 85 5. fejezet UHPLC-FLD analitikai módszer validálása az aflatoxin B1 és az ochratoxin A egyidejű meghatározására patkány plazmában, májban és vesében 109 6. fejezet Az aflatoxin B1 és ochratoxin A toxicitásának és toxikokinetikájának megközelítése F344 patkányok egyidejű orális beadása után 135 7. fejezet Az Ochratoxin A csökkenti az aflatoxin B1 genotoxicitását: Az in vivo micronucleus és az üstökös vizsgálat egyidejű alkalmazása 159 8. fejezet Általános vita 187 9. fejezet/9. fejezet Következtetések/Következtetések 207 17

1. Fejezet/1. Fejezet Általános bevezetés/Általános bevezetés

1. fejezet/1. fejezet AFLATOXIN B1 Kémiai tulajdonságok Az AFB1 a difurán-kumarin családba tartozik. Szisztematikus nómenklatúrája: 2,3,6aα, 9aα-tetrahidro-4-metoxi-ciklopenta [c] -b-furo [2 ', 3': 4,5] furo [2,3-h] kromén-1,11-dion A C 17H 12O 6 molekulatömege 312,27 g/mol. Kémiai szerkezetének kis eltérései a természetben megtalálható aflatoxinok halmazát eredményezik (AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2). Az AFB1 a legmagasabb koncentrációjú, ezt követi az AFG1, AFB2 és AFG2. Ezeknek az anyagoknak az akut és krónikus toxicitásuk tekintetében történő követési sorrendje az AFB1> AFG1> AFB2> AFG2, és közvetlenül összefügg azzal, hogy epoxidot képezhetnek a 8-9 kettős kötésnél (az ábrán piros nyíllal jelölve), és a ciklopentenon gyűrűkhöz (kék nyíl) társult hatásosság (McLean és Dutton, 1995). Az M1 és M2 aflatoxinok a B1 és B2 aflatoxinok oxidatív metabolizmusának hidroxilezési termékei. 1. ábra: A természetben jelen lévő aflatoxinok (EFSA, 2007) 24

Általános bevezetés/Általános bevezetés, amely indukálja a 8-OHdG képződését patkány és kacsa májban. Ez a DNS-károsodás indukálhatja a G> T transzverziót, ami hozzájárulhat az AFB1 karcinogenitásához (Bedard és Massey, 2006). 4. ábra: Az AFB1-DNS addukt evolúciója (Smela et al., 2002) 31

1. fejezet/1. fejezet, hogy az OTA fenolos formájában (OTA -) fenoxónium-kationtá alakul (8. ábra, J), amely viszont OTAQ -vá (8. ábra, K) alakul át (Ringot et al., 2006; Dai et al., 2002). Másrészt az OTA ismételt beadása képes jelentősen csökkenteni az intracelluláris antioxidánsok, például a glutation (GSH), a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a kataláz (CAT) vagy a glutation-peroxidáz (GSPx) szintjét a májban és a vesében (Meki és Hussein, 2001) és fokozza a lipidperoxidációt (Khan és mtsai, 1989). A szerkezet-aktivitás vizsgálatok szerint a klóratom elengedhetetlen az OTA genotoxikus hatásához, mivel a DNS-károsodást kiváltó klórozott vegyületek előzetesen bioaktivációs folyamaton mennek keresztül a benzokinonok számára (Ringot és mtsai, 2006). 8. ábra: ROS-képződés OTA-val (Ringot et al., 2006) A génexpressziós vizsgálatok kimutatták, hogy az OTA intenzívebben képes csökkenteni az intracelluláris oxidatív védelemben részt vevő gének expresszióját a májban, mint a vesében (Cavin és mtsai. 2007; Arbillaga et al., 2008); és ez növeli a nitrogén-oxid szintetáz 40 expresszióját

Általános bevezetés/Általános bevezetés indukálható (inos), a nitrogén-oxid (NO) termeléséért felelős enzim. Az NO reagálhat az O 2 -val, és peroxinitriteket generálhat, amelyek reaktív nitrogénfajokká (RNS) fejlődnek, amelyek reagálnak a DNS-sel és a fehérjékkel (Marin Kuan et al., 2011). A rendelkezésre álló információk arra utalnak, hogy az OTA valószínűleg nem egyetlen cselekvési mechanizmuson keresztül fog cselekedni. Az OTA, különösen a vesében, közvetlenül (a redoxi ciklusokat megváltoztató gyökök képződése) és közvetve (az antioxidáns védekezés csökkenése) generál oxidatív stresszt. Mindkét mechanizmus kölcsönhatásba léphet, mivel a védekezés csökkenése felerősíti a szabad gyökök termelésének hatását (Marin Kuan et al., 2011). Ezért az OTA rákkeltő hatásáért felelős hatásmechanizmus az epigenetikus mechanizmusok kölcsönhatása lesz, ideértve a fehérjeszintézis gátlását, az oxidatív stresszt és bizonyos sejtjelzési útvonalak aktiválódását (Marin Kuan és mtsai., 2008 ). 41

1. fejezet/1. fejezet rétegei, alacsonyabb mennyiségű AFB1 és OTA mennyiséget figyeltek meg az emlőben, a májban és a vesében, valamint a petesejtekben (Zahoor Ul Hassan et al., 2011). A meglévő adatok azt mutatják, hogy az antagonizmusok, szinergiák és additív hatások megállapítására szolgáló megfelelő vizsgálatok ritkák és nehezen értelmezhetők. Kiindulásként megkísérelhetjük megérteni a mikotoxinok együttes toxicitását a sejtben kifejtett egyedi hatásmechanizmusuk alapján. Így hasonló hatású mikotoxinokban additív hatásokra lehet számítani, sőt egyes kölcsönhatások antagonisztikusak lehetnek (Speijers, 2004). Az AFB1 és az OTA esetében a hatásmechanizmusok nagyon eltérőek, de mindkettő a citokróm P450 biotranszformációjában kezdődik, így bármilyen típusú asszociáció előfordulhat. A gyakorlatban a kapott kvantitatív vagy kvalitatív eredmény nagyon eltérhet a vártól, és amint azt felülvizsgáltuk, az AFB1 és az OTA bármilyen típusú kölcsönhatást eredményezhet közöttük in vitro és in vivo. Úgy tűnik, hogy az eredmény az elvégzett faj- vagy toxicitási vizsgálattól, vagy akár az alkalmazott végpont típusától függ. 44.

1. fejezet/1. fejezet WHO, 2001. Az élelmiszerekben található egyes mikotoxinok biztonsági értékelése. WHO Élelmiszer-adalékanyagok sorozat 47. Wild, C. és Gong, Y., 2010. Mycotoxinok és emberi betegségek: nagymértékben figyelmen kívül hagyják a globális egészségügyi problémát. Karcinogenezis 31, 71-82. Williams, J. H., Phillips, T. D., Jolly, P. E., Stiles, J. K., Jolly, C. M. és Aggarwal, D., 2004. Emberi aflatoxicosis a fejlődő országokban: a toxikológia, az expozíció, a lehetséges egészségügyi következmények és a beavatkozások áttekintése. Am J Clin Nutr 80, 1106-1122. Wong, Z.A. és Hsieh, D.P.H., 1980. Az aflatoxin B1 összehasonlító metabolizmusa és toxikokinetikája majomban, patkányban és egérben. Toxicol Appl Pharmacol 55, 115-125. Xiao, H., Madhyastha, S., Marquardt, R. R., Li, S., Vodela, J. K., Frohlich, A. A. és Kemppainen, B. W., 1996. Az Ochratoxin A toxicitása, annak nyitott laktonformája és számos analógja: A szerkezet aktivitása összefüggései. Toxicol Appl Pharmacol. 137, 182-192. Zahoor Ul Hassan, M. Z., Khan, A., Khan, I., Javed, Z. és Hussain, 2011. Az ochratoxin A és az aflatoxin B (1) egyedi és kombinált alkalmazásának hatása a Leghorn tenyésztő tyúkok szöveteiben és petéiben. J Sci Food Agric doi: 10.1002/jsfa.4740. Zeljezic, D., Domijan, A.M. és Peraica, M., 2006. Patkány vesében az ochratoxin A által okozott DNS károsodás lúgos üstökös vizsgálattal. Braz J Med Biol Res 39, 1563 54

Cél, célok és vázlat 2. fejezet

Cél, célok és vázlat 8. fejezet: Az előző fejezetek legfontosabb megállapításait ebben a szakaszban tárgyaljuk. 9. fejezet: Bemutatjuk a kutatási projekt fő következtetéseit. 59

Az Ochratoxin A csökkenti az üstökösvizsgálattal kimutatott aflatoxin B1 által kiváltott DNS-károsodást a Hep G2 sejtekben Laura-Ana Corcuera., Leire Arbillaga, Ariane Vettorazzi, Amaia Azqueta, Adela López de Cerain Élelmiszer- és kémiai toxikológia 49 (2011) 2883 2889

3. fejezet Összegzés A mikotoxinok, az aflatoxin B1 (AFB1) és az ochratoxin A (OTA) együtt lehetnek jelen az élelmiszerekben. Ezeket az élelmiszer-szennyeződéseket különböző mechanizmusok révén fellépő genotoxinoknak tekintik. A munka célja mindkét mikotoxin kombinált genotoxikus in vitro hatásainak jellemzése Hep G2 sejtekben. Ebből a célból a citotoxicitást először izolált és kombinált kezelésekben határozták meg a genotoxicitási vizsgálatok dózistartományának meghatározása céljából. A sejtek AFB1 + OTA 24 órán át történő együttes expozíciója additív hatásokat eredményezett. A genotoxicitást Hep G2 sejtekben restrikciós enzimekkel (endo III és FPG) végzett módosított üstökös vizsgálattal határoztuk meg. Jelentős reaktív oxigénfajták képződését mutatták ki mind az egyszeri, mind a kombinált kezelések során. Az AFB1 genotoxikus volt 3 óra múlva, külső metabolikus aktivációval (S9 keverék), és 24 óra elteltével metabolikus aktiváció nélkül. Az OTA együttes expozíciója jelentősen csökkentette az AFB1 által kiváltott DNS károsodást, nemcsak a törésekben és az apurinikus helyeken, hanem az FPG-érzékeny helyeken is. Az additív citotoxikus hatások és az antagonikus genotoxikus hatások látszólagos ellentmondása magyarázható, ha az AFB1 és az OTA ugyanazokért a CYP-okért versenyez, és több ROS-t, de kevesebb AFB1-adduktot eredményez. 64.

Az OTA csökkenti az AFB1 genotoxicitását in vitro 1. táblázat: IC50 értékek a Hep G2 sejtvonalban 24 óra egyszeri vagy kombinált kezelés után. IC50 µm HepG-2 AFB1 100 OTA 360 OTA + 100 µm AFB1 100 OTA + 150 µm AFB1 200 1. ábra: A Hep G2 életképességi görbéi 24 órás inkubálás után, kizárólag OTA-val és AFB1-gyel kombinálva, MTT-vizsgálattal nyertek. A mikotoxinok együttes szignifikáns hatásának megfigyelése céljából mindegyik kombinációt összehasonlítottuk OTA (p 0,05) vagy 100 és 150 µm AFB1 egyszeri kezelésével (nincs jelzés). Három kísérlet átlaga és SD-je látható. Genotoxicitás 3 órán át S9 patkánykeverék nélkül az AFB1 nem indukált DNS-szál töréseket vagy AP helyeket (2A. Ábra), és az enzimkezelést követően nem találtunk jelentős károsodást (2B. Ábra). Ezzel szemben, amikor metabolikus aktiválást alkalmaztunk, szignifikáns dózis-válasz összefüggés volt látható a közvetlen DNS-szál törésekben 30 µm-től kezdődően (2C ábra). Ezenkívül a DNS károsodásának jelentős növekedését detektálta az FPG azonos koncentrációban (2D. Ábra). 24 órás AFB1-kezelés után dózisreakciós hatást figyeltünk meg jelentős DNS-indukálta szálszakadásokkal (2E. Ábra). Ezenkívül 6 µm-nél egyértelmű FPG-helyek egyértelmű indukcióját mutatták ki, amelyek 3 óra múlva nem jelentek meg (2F ábra). 71. sz

Az OTA csökkenti az AFB1 genotoxicitását in vitro 2. ábra: Az AFB1 genotoxikus hatása 3 óra (A és B), 3 óra és 2,5% S9 patkánykeverék (C és D) és 24 óra kezelés (E és F) után üstökösvizsgálattal . A DNS károsodását tetszőleges egységekben mértük (0-400). A DNS-szálszakadásokat és az AP-helyeket ábrázoljuk A, C és E-ben. Az enzimekkel történő utólagos emésztés során észlelt oxidatív károsodások nettó endo III-ként (narancssárga) és nettó FPG-érzékeny helyekként (sárga) vannak ábrázolva B, D és F. A kezelések jelentős hatásainak megfigyelése érdekében mindegyik koncentrációt összehasonlítottuk a kezeletlen sejtekkel (C-) (* p 0,05). Három kísérlet átlaga és SD-je látható. 73.

3. fejezet 3. ábra: A DNS-károsodás összehasonlító ábrái az üstökösvizsgálattal mért 24 órás Hep G2 sejtek AFB1 és AFB1 + 50 µm OTA hatásának kitéve. A DNS károsodását tetszőleges egységekben mértük (0-400). A DNS károsodást DNS-szál töréseként és AP helyek (A) vagy oxidatív károsodásokként mértük, nettó endo III (B) vagy FPG (C) érzékeny helyeken kifejezve. A kezelések közötti szignifikáns különbségek megfigyelése érdekében az AFB1 + OTA kombinációkat összehasonlítottuk az AFB1 egyszeri expozícióival (* p 0,05). Három kísérlet átlaga és SD-je látható. 4. ábra: AFB1-gyel (kék kék színű A), OTA-val (B) és AFB1 + 50 µm OTA (világos kékben) 24 órán át elegyített Hep G2 sejtek intracelluláris ROS-ja. A ROS-szinteket a túlélés százalékában kifejezett fluoreszcenciában fejeztük ki. Az eredményeket összehasonlítottuk negatív kontrolljukkal (* p 0,05). Négy kísérlet átlagát és SD-jét mutatjuk be. 74.

Az OTA csökkenti az AFB1 genotoxicitását in vitro 1082-1090. Turesky, R. J., 2005. Perspektíva: Az ochratoxin A nem genotoxikus karcinogén. Chem Res Toxicol 18, Uhl, M., Helma, C. és Knasmuller, S., 1999. Egysejtű gélelektroforézis vizsgálatok humán eredetű hepatoma (Hep G2) sejtekkel. Mutat Res 441, 215-224. Urrego Novoa, J.R. és Diaz, G. J., 2006. Aflatoxinok és toxicitási mechanizmusai májrákban. Rev Fac Med Una 54., 108-116. Wang, H. és Joseph, J. A., 1999. A sejtszintű oxidatív stressz mennyiségi meghatározása diklór-fluoreszcein-vizsgálattal mikrolemez-leolvasóval. Free Radic Biol Med 27, 612-616. 83.

4. fejezet A polifenollal dúsított kakaó kivonat csökkenti a Laura-Ana Corcuera, Susana Amézqueta, Leire Arbillaga, Ariane Vettorazzi, Sonia Touriño, Jusep Lluis Torres, Adela López de Cerain mikotoxinok által termelt szabad gyököket Élelmiszer- és kémiai toxikológia 50 (2012) 989-995

A PECE felhasználásig in vitro -20 ° C-on tartja a szabad gyököket. A PECE és az AFB1 oldatokat sötétben tartottuk, hogy elkerüljük a fény lebomlását. A kísérleteket magzati borjúszérum (FCS) nélkül végeztük, hogy elkerüljük a szérum kölcsönhatását a PECE-vel vagy a mikotoxinokkal a fehérjékhez. Statisztikai elemzés Három független kísérletet végeztek a citotoxicitás és a ROS-indukció ellenőrzésére. Az adatokat leíró elemzéssel mutatjuk be [a replikált kísérletek átlag ± szórása (SD)]. Az összehasonlításokat nem-parametrikus Kruskal-Wallis H-próbával és Mann-Whitney U-próbával végeztük. A szignifikancia szintjeként P 0,05 értéket fogadtunk el. Eredmények A PECE előállítása és az átlagos polifenol-összetétel C és EC monomereket és oligomereket tartalmazó víz: aceton 3: 7 arányú kakaó-kivonatot készítettünk az előzőekben leírtak szerint. A C, EC, Cya-Cat és Cya-EC kalibrációs görbéit készítettük, lefedve a munkaterületet. Minden vegyület hat standardját elemeztük, és lineáris választ kaptunk a koncentrációhoz viszonyítva. A minták elemzését három példányban, RSD-vel végeztük