BIBLIOGRÁFIAI FELÜLVIZSGÁLAT ALACSONY SŰRŰSÉGŰ POLITETILÉN BIODEGRÁDÍTÓ MIKROORGANIZMUSOKRÓL ÉS AZ ANYAGOKRA VONATKOZÓ HATÁSOKRÓL Nelson Ricardo Acuña Molina FRANCISCO 2017
BIBLIOGRÁFIAI FELÜLVIZSGÁLAT AZ ALACSONY Sűrűségű polietilén biodegradációjú mikroorganizmusokhoz és ezeknek az anyagra gyakorolt hatása Társigazgató: Mario Sánchez Rodríguez PhD. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS TUDOMÁNYI ÉS OKTATÁSI KAR BACHELOR TANTERVES PROJEKTJE A KÉMIABAN BOGOTA D.C. 2017 I
Elfogadó jegyzet A zsűri zsűri elnöke Zsűri Bogotá D.C. (2017. március 01.) II
Elkötelezettség édesanyámnak és minden tanárnak, akik ösztönözték és fokozták kíváncsiságomat és szeretetemet a tudomány iránt, valamint azoknak, akik irányították és segítették megszerezni tudományos ismereteimet és készségeim. III
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönöm édesanyámnak a folyamatos támogatást, a tanáraimnak minden tanításukat, különösképpen az igazgatóimnak és a rendezőtársamnak, Jorge-nak, Josué-nak és Mario-nak az erőfeszítésért és a támogatásért, minden barátomnak, akik valamilyen módon hozzájárultak tanácsaikkal és javaslataikkal. ennek a munkának a megvalósításában különösen David Leonardo Castilla és Néstor Alexander Zambrano, akik véleményükkel és javaslataikkal szívesen járultak hozzá. IV
TARTALOM X táblázatok listája X ábra ábrák listája XI ábrák listája XIII ábrák listája mellékletek listája XIV rövidítések XV szójegyzék XVI 1. ÖSSZEFOGLALÓ 1 2. BEVEZETÉS 2 3 CÉLKITŰZÉSEK 2 3.1 Általános célok 2 3.2 Konkrét célok 3 4. Háttér és indoklás 3 4.1. A 3. feladat meghatározása 4.2. Történelmi áttekintés 4 4.3 Az LDPE ellenőrzésének alternatívái 5 4.3.1 Az LDPE hulladéklerakóiban történő temetkezés 5 4.3.2 Az LDPE elégetése 5 4.3.3 Az LDPE pirolízise 6 4.4. Újrahasznosítási politikák 6 4.4.1 Az LDPE által okozott környezeti probléma 7 5 ELMÉLETI KERET 7 5.1 Polimerek 8 5.1.1 Műanyagok 8 5.1.2 Poliolefinek 8 5.1.2.1.1 Polietilén (PE) 8 5.1.2.1.2 A PE 8 besorolása 5.1 .2.1.2.1 Kis sűrűségű polietilén (LDPE) 9 5.1.2.1.2.2 Lineáris kis sűrűségű polietilén vagy (LLDPE) 9 5.1.2.1.2.3 Nagy sűrűségű polietilén (HDPE) 9 5.1.2.1.2.4 A kémiai tehetetlenség okai polietilénből 10 5.2 Biopolimerek az LDPE pótlásához 10 5.2.1 Természetes biopolimerek 10 5.2.2 Szintetikus biopolimerek 10 5.2.3 Bioplasztikák 11 5.2.3.1 Biológiailag teljesen lebontható bioműanyagok 11 5.2.3.2 Bio-fragmentálható bioműanyagok 11 5.3 Bioremediáció 11 5.3.1 Alacsony biológiai lebomlás sűrűségű polietilén 11 (LDPE) 5.3.1.1 Biodegradáció 12 5.3.1.2 Asimiláció 12 V
5.4.2.6.1 A mikrobiális biofilm életképessége 62 5.4.2.6.2 Előzetes jellemzési vizsgálatok 62 5.4.2.6.3 Specifikus azonosítási vizsgálatok 62 5.4.2.7 Biológiai lebonthatóság termékei 62 5.5 Javasolt módszer 63 5.5.1 Életképességi teszt mikroorganizmusok 64 életképesek lemezenként hígítás 5.5.1.1. Mintavétel és LDPE-bontó mikroorganizmusok kiválasztása folyékony közegben SM 5.5.1.2 Előzetes azonosítás 65 5.5.1.3 Előzetes gomba-azonosítási vizsgálatok 66 5.5.1.4 In vitro biodegradációs teszt 67 5.5.2 Tömegvesztés-vizsgálat 67 5.5.3 Specifikus azonosítás 65 5.5.3.1 Technika 69 restrikciós fragmens hosszúságú polimorfizmusok (RFLP) 5.5.4 Instrumentális vizsgálatok 69 5.5.4.1 Az FTIR alkalmazása az LDPE biodegradáció vizsgálatához 69 5.5.4.1.1 A technika változatai 69 5.5.4.1.1.1 FT-IR spektroszkópia ATR 69 5.5.4.1.1.2 FT-IR diffúz reflektancia (DRIFT) 70 5.5.4.1.2 Oxidációs kvantifikációs indexek 70 5.5 .4.1 .2.1 Karbonil-index (CI) 70 5.5.4.1.2.2 Vinil-index (IV) 70 5.5.4.1.2.3 Az LDPE 70 kristályosságának százalékos aránya (%) a CO 2 -termelés 71 6 ELEMZÉS 72 7. KÖVETKEZTETÉSEK 77 8. AJÁNLÁSOK 78 9. BIBLIOGRÁFIA 79 65 IX
ÁBRÁK FELSOROLÁSA 1. ábra: egyenes lineáris kis sűrűségű polietilén (LLDPE) 9 1. ábra b b kis sűrűségű polietilén (LDPE) 9 1. ábra c nagy sűrűségű polietilén HDPE 9 2. ábra Az LDPE biodegradációját befolyásoló tényezők 13 3. ábra A polietilén hipotetikus átalakulásának útjai teljes ásványosodása 14 4. ábra: PE biológiai lebomlása β-oxidációval 14 5. ábra PE oxidáció iniciátorai 15 6. ábra Hemolitikus repedés vagy fotolízis mechanizmusa 16 7. ábra Fémes ágensből történő iniciálás 16 8. ábra Foto-oxidáció terjedése 17 9. ábra A mechanizmusok oxidáció az 1. és 2. típusú Norrish-reakciókat követően A metabolikus azonosítás 66. ábra A specifikus azonosításhoz elvégzendő módszer a 68 14. ábra Eljárás LDPE biológiailag lebontható mikroorganizmusok izolálására 15. ábra Eljárás LDPE lebontó mikroorganizmusok tenyésztésére, izolálására és azonosítására 100 101 XI
A GRAFIKÁK FELSOROLÁSA 1. ábra: A világ műanyagtermelésének változása 1950 és 2010 között 1. grafikon. B A világ műanyagtermelésének változása 1950 és 2013 között. 2. ábra. A bejelentett műfajok aránya, amelyek az (LDPE) grafikon lebomlásához kapcsolódnak 3. Technikák leggyakrabban az LDPE biodegradációjának tanulmányozására használják 4 4 75 76 XIII
MELLÉKLETEK FELSOROLÁSA A1. A2. MELLÉKLET B. MELLÉKLET LDPE biológiailag lebontható mikroorganizmusok izolálása és számlálása az RFLP-t használó mikrobacsoportok között 106 G1. MELLÉKLET. Bakteriális azonosító vizsgálatok 107 G2. MELLÉKLET. Bakteriális azonosító vizsgálatok 108 G3. MELLÉKLET. Bakteriális azonosító vizsgálatok 109 G4. MELLÉKLET. Baktériumok azonosítási vizsgálata 110 H. MELLÉKLET A tápközeg és az anyagok felsorolása 111 I. MELLÉKLET Javasolt eljárás vetésre 114 J1. MELLÉKLET Baktériumok előzetes jellemzőinek táblázata 115 J2. MELLÉKLET Bakteriális előzetes jellemzők 116 J3. MELLÉKLET Bakteriális előzetes jellemzők 117 K1. MELLÉKLET FTIR K2. MELLÉKLET Eljárás a polietilén elemzésére az FTIR L1. MELLÉKLET segítségével A CO 2 termelés számszerűsítése és a metabolitok azonosítása L2. MELLÉKLET A CO 2 termelés mennyiségi meghatározása és a metabolitok azonosítása
5.1.2.1.2.1 Kis sűrűségű polietilén LDPE szerkezete erősen elágazó (a szénatom körülbelül 2% -ában) [51]. Molekulatömege 100 000-300 000 [g/gmol], sűrűsége pedig 0,90-0,91 [gr/cm 3], ez a legkisebb sűrűség, és ezt reológiai tulajdonságai tükrözik, eldobható zacskók gyártására használják. 5.1.2.1.2.2. A kis sűrűségű lineáris kis sűrűségű polietilén vagy (LLDPE), amely kevéssé elágazó változat, a köztes kristályosság közé sorolható, 0,915 g/cm3 érték viszonylag kompakt. 5.1.2.1.2.3 Nagy sűrűségű polietilén (HDPE) Szerkezete mutatja a legnagyobb linearitási fokot, molekulatömege 200 000-400 000, [g/gmol] és sűrűsége 0,94-0,97 0,91 -0,94 [gr/cm 3], emiatt nagyon merev és erős anyag, amelyet műanyag kannák gyártásához használnak. a) b) 1000 c) 4000 1000 Az 1. ábra polietilén szerkezete, a) lineáris kis sűrűségű polietilén (LLDPE); b) kis sűrűségű polietilén (LDPE); c) nagy sűrűségű polietilén HDPE. 9.
az anyag oxidációs foka és a hozzáadott adalékanyag típusa, amely lehet keményítő vagy prooxidáns. A közölt munkák eredményeként egy hipotetikus biodegradációs mechanizmust hajtottak végre, amelyet az alábbiakban mutatunk be. 3. ábra A polietilén transzformációjának hipotetikus útjai a teljes ásványosodásig a [63, 45, 68] cikkek alapján. 4. ábra A PE biodegradációja β-oxidációs forrás által [65] 14
A szerző tisztában van azzal, hogy mennyi időigényes és költséges lehet ennyi teszt elvégzése, mind az előzetes azonosítás, mind a konkrét azonosítás hónapokig, esetleg évekig tarthat. Az alapvető módszertani felépítés a következő lesz: 11. ábra Javasolt alapvető módszertani séma 5.5.1 Életképes mikroorganizmusok életképességi tesztjeinek száma lemezhígítással A lemez életképességi vagy hígítási tesztjét és a telepképző egységek számát javasoljuk, mert könnyű és gyors, de lehetővé teszi a hidrokarbonoklaszt mikroorganizmus-fajok szétválasztása és individualizálása (legalábbis azok, amelyek in vitro életben maradhatnak). (Lásd az L2. MELLÉKLETET) Számítások 1) Csak azokat a dobozokat (hígításokat) számolja, amelyek 30–300 telepet tartalmaznak. 2) A következő egyenlettel számítsa ki a CFU/g s.s. CFU/g pe. = (NC 1/FD 1/V)/(P FH). Hol: CFU/g pe. = telepképző egységek/g PE. NC = telepek száma egy dobozban. FD = hígítási tényező, amely megfelel annak a hígításnak, amelyből a mintát beoltják a dobozba (10–2–10–10). V = a dobozba beoltott térfogat = 0,1 ml. P = nedves minta tömege = 1 g. FH = páratartalom-korrekciós tényező (1 (% páratartalom/100)). 64.
5.5.1.1. Mintagyűjtés és LDPE-bontó mikroorganizmusok kiválasztása SM folyékony közegben Javasolt egy szelektív SM folyékony táptalaj készítése, mert ideális az LDPE biológiailag lebontható mikroorganizmusok kifejlesztéséhez, és több biodegradációs vizsgálatban is tesztelték, amely generál megbízhatóság. A minta összegyűjtése A minta előkezelése Adagolás a folyékony táptalajhoz Inkubálás (lásd az A. mellékletet 2). 5.5.1.2 Előzetes azonosítás A baktérium nemzetségek azonosításához a következő biokémiai és mikrobiológiai vizsgálatokat lehet elvégezni, például kataláz baktériumok esetében (lásd G1. MELLÉKLET). nak nek. Thioglycollate Broth OF; b. Oxidáz teszt c. Kataláz teszt d. Malonát teszt e. Citrát teszt j. Fermentációs teszt, 2,3-butándiol és kevert sav. F. Hippurát teszt g. Kligler-teszt h. Tsi vas három cukrot i. MR/VP teszt k. Lizin-vas-agar l. Fenilalanin-deminanáz-agar m. Moeller n. A 65. aminosavak dekarboxilezése
12. ábra A metabolikus azonosítás előzetes módszerei 5.5.1.3 Előzetes tesztek a gombák azonosítására A gombák esetében a következő vizsgálatokat kell elvégezni: A PE lebontó gombák izolálásához és számlálásához ugyanazt a technikát és táptalajt használtuk, mint a baktériumok esetében, az a különbség, hogy Rose Bengal-t és sztreptomicint adunk a táptalajhoz, és a pH-t 4,9-re állítjuk [187]. Termesztésükhöz sabouraud agar, PDA, laktofenol kék pamut (LPCB) használható, azonosításukhoz mikroszkópos és makroszkópos megfigyelés használható. 66
Ezekkel az univerzális primerekkel a PCR-ből származó amplifikált gén alikvotái olcsón szekvenálhatók kereskedelmi laboratóriumokban, vagy sok esetben egyetemi laboratóriumokban. Amint az rrna gén szekvenciája ismert, felhasználhatók az eredeti mikroorganizmusok azonosítására nemzetségi és faji szinten [271]. Számos baktériumfaj szekvenciáját számítógépesítették az adatbázisokban [271]. Ez lehetővé teszi egy ismeretlen rrna-szekvencia és egy ismert baktérium-szekvencia összehasonlítását [271]. Számos szekvenciaelemző program áll rendelkezésre a szekvenciák azonosításához. Az egyik ilyen adatbázis a BLAST (Basic local alignment search tool), amely a helyi alap igazítás kereső eszközt jelenti, amelyet az (NCBI) nemzeti központ biztosít a biotechnológiai információkhoz, és amely elérhető az interneten [271]. A 16S rrna univerzális primerek a [271] -ből származnak. 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGY * TACCTTGTTACGACTT * Y lehet C vagy T degenerált alapállás. 13. ábra A specifikus azonosításhoz alkalmazandó módszertan 68
korlátozzák használatukat [67], még ezeken is javításra van szükség. Ha mindezen akadályok leküzdésre kerülnek, akkor hamarosan a probléma véglegesen megoldódhat, vagy más új problémák merülhetnek fel, csak az idő fogja megmondani, de a társadalom cselekedeteink visszaélése, felelőtlensége és tudattalanja továbbra is az lesz, és ezeknek kell lenniük. kiirtani a társadalom fejéből. Az az igazság, hogy bár a legtöbbet jelentették őket, ez nem jelenti azt, hogy ők csinálják a legjobban ezt a munkát, egyszerűen csak az, hogy az eddigi legelterjedtebbek. Kétségtelen, hogy az Aspergillus sp. Ők a legelterjedtebb polietilént lebontó mikroorganizmusok, amelyeket eddig találtak, nagyon távol vannak a többi 81 fajt tartalmazó nemzetségtől, ami azt mutatja, hogy a gombák nagyon sokoldalúak és igénytelenek a környezet, az élelmiszer és a körülmények szempontjából, ráadásul nagyon népszerűek a kutatók körében. A 2. ábra az (LDPE) biodegradációjához kapcsolódó gombák és baktériumok nemzetsége által kapott referenciák számát mutatja. 75
A1. MELLÉKLET LDPE-bontó mikroorganizmusok izolálása és számlálása A 14. ábrán bemutatott eljárás a LDPE biológiailag lebontható mikroorganizmusok izolálására [187, 94] alapján adaptálva. A PE lebontó gombák izolálásához és számlálásához ugyanazt a technikát és táptalajt alkalmaztuk, mint a baktériumok esetében. hogy a tápközeghez rózsabengáliát és sztreptomicint adunk, és a pH-t 4,9-re állítjuk. 100
A2. MELLÉKLET LDPE-bontó mikroorganizmusok izolálása és azonosítása 15. ábra: LDPE-bontó mikroorganizmusok tenyésztésének, izolálásának és azonosításának eljárása. 101
B. MELLÉKLET LDPE-bontó mikroorganizmusok tisztítása és izolálása 16. ábra Eljárás az LDPE-bontó mikroorganizmusok izolálására és későbbi szaporításukra DNS-kivonás céljából. A gombás DNS kinyerése érdekében nem szabad agarra vetni, mert a kaparás során tápközeg nyomai maradnak, amelyek zavarják a DNS kivonását. A javasolt módszer Rojas Triviño [276] által regisztrált.
C. MELLÉKLET LDPE biológiai lebonthatósági vizsgálat 17. ábra In vitro biológiai lebonthatósági teszt [237, 126] 103 alapján adaptálva
D. MELLÉKLET DNS kivonása gombákból 18. ábra A javasolt módszer a Mahaku által [203] módosított módszer. 104
E. MELLÉKLET DNS kivonása baktériumokból 19. ábra A DNS kivonásának módszere a Nemzetközi Trópusi Mezőgazdasági Központ-CIAT által kivont puffer (CTAB) használatával bejegyzett módszer. 16. táblázat a szükséges reagenseket a megfelelő koncentrációikkal vette át [276] Reagens koncentráció NaCl 5 M 14 ml EDTA ph 8,0 0,5 M 2,0 ml Tris-HCl ph8,0 1 M 5 ml SDS - 0,5 g Steril desztillált víz Töltsük fel 50 ml reagenskoncentrációra NaCl 1,4 M 8,18 ml EDTA ph 8,0 20 mM 4, 0 ml Tris-HCl ph8,0 100 mM 10 ml CTAB 2% 2 g PVP 40 1% 1 g 20. ábra A mikrobiális DNS mennyiségi meghatározása 105
F. MELLÉKLET Mikrobiális csoportok közötti megkülönböztetés a restrikciós töredékhosszú polimorfizmus (RFLP) alkalmazásával 21. ábra: módszertani javaslat az RFLP technika végrehajtására [277]. 106.
G1. MELLÉKLET Bakteriális azonosító vizsgálatok 22. ábra: baktériumok azonosítása LIA agar teszt, Kligler, tioglikolát és triptofán alkalmazásával. 107.
G2. MELLÉKLET Bakteriális azonosító tesztek 23. ábra Mikrobiális azonosítási tesztek, keményítőformák, TCI, kataláz-oxididáz 108
G3. MELLÉKLET Bakteriális azonosító vizsgálatok 24. ábra Lizin-ornitin-dekarboxilezési tesztek, fenilalanin-deamináz 109
G4. MELLÉKLET 25. ábra MRI VP, OF és glükóz fermentációs tesztek 110