Granadai Egyetem hivatalos doktori program a biomedicinában A PRPF40B transzkripciós és splicing faktor biokémiai és funkcionális jellemzése Soraya Becerra Ortiz López-Neyra Granada Parazitológiai és Biomedicinológiai Intézet, 2015

transzkripciós

Kiadó: Granadai Egyetem. Doktori disszertáció Szerző: Soraya Becerra Ortiz ISBN: 978-84-9125-072-2 URI: http://hdl.handle.net/10481/40006

SORAYA BECERRA ORTIZ doktorandusz és CARLES Mª SUÑÉ NEGRE doktori értekezés címe A PRPF40B ÁTJELENTÉS ÉS SZLETELŐ FAKTOR BIOKÉMIAI ÉS FUNKCIÓS JELLEMZŐI: A doktori disszertáció aláírásával garantáljuk, hogy a munkát a doktori hallgató végezte a dolgozat rendezőjének iránya és amennyire ismereteink eljutnak a munka elvégzéséhez, más szerzők hivatkozandó jogait tiszteletben tartották, amikor eredményeiket vagy publikációikat felhasználták. Granada, 2015. január 28. A doktori disszertáció igazgatója Aláírva: Dr. Carles Mª Suñé Negre Aláírva: Soraya Becerra Ortiz

funkcionális vizsgálatokkal megmutatjuk, hogy a PRPF40B képes transzkripció aktiválására is. Kimutattuk azt is, hogy a myelodysplasticus szindrómához kapcsolódó mutációk drasztikusan csökkentik a PRPF40B transzkripciós aktivációs képességét.

I. RÖVIDÍTÉSEK 1 II. BEVEZETÉS 7 1. GÉNKIFEJEZÉS. ÁTÍRÁS 9 1.1 RNS-polimeráz 9 1.2 RNAPII CTD 9 1.3 A transzkripció szakaszai 10 1.3.1 Kezdeményezés 10 1.3.2 Nyúlás 10 1.3.2. Végződés 11 1.4 A transzkripció szabályozása 12 2. Az mRNS feldolgozása 14 2.1 A spliceosoma 14 2.2 A 16 exon meghatározása 2.3 Alternatív splicing 17 2.4 Alternatív splicing típusai 18 3. SPLICING SZABÁLYOZÁSA 19 3.1. CIS szabályozási elemek 19 3.2. A transz szabályozásának elemei 19 3.3 Az illesztés szabályozási mechanizmusai 22 4. ÁTJELENTÉS CSATLAKOZTATÁSA ÉS SPLICLING 25 4.1 Kinetikai modell 25 4.2 Rekrutációs modell 28 4.2.1 Transzkripciós és splicing kapcsolási tényezők 29 4.2.2 WW doménnel rendelkező fehérjék és FF 31 AZ EUKARI SEJT 38 5.1 Nukleáris foltok 39 5.1.1 A nukleáris foltok működése 40 5.1.2 A nukleáris foltok összetétele 41 5.1.3 Jelzési tartományok a nukleáris foltok felé 42 6. APOPTOSIS 44 6.1 Külső út 45

6.2 Belső út 45 6.3 Caspases 46 7. APOPTOSIS ÉS SPLICING 48 7.1 Fas szabályozás 49 8. ALTERNATÍV SPLEICING ÉS A BETEGSÉG 51 8.1 A splicing rendellenességek típusai 51 8.2 Alternatív splicing és az idegrendszer 52 8.3 Alternatív splicing a rákban 54 III. CÉLOK 57 IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 61 1. PLASmidok 63 2. Sejtkultúrák és transzfekciók 65 2.1 Sejtkultúrák 65 2.2 Transzfekciók 66 2.3 Sejtkultúrák fertőzése 67 3. MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI ELJÁRÁSOK 68 3.1 Immunfluoreszcencia 68 3.2 RNS kivonás és RT-PCR 69 3.3 Teljes RNS kivonása tömb analízishez 71 3.4 PRPF40B irányított mutagenezise 72 3.5 Luciferáz aktivitási vizsgálatok 72 3.6 In vivo fehérje-fehérje interakciós vizsgálatok 73 3.7 In vitro fehérje-fehérje interakciós vizsgálatok 74 4. Sejtszintű biológiai eljárások 74 4.1 Sejtpusztulás és sejtciklus vizsgálata 75 4.2 Annexin V kötési vizsgálat 75 4.3 Kaszpáz-3 aktivitás mérése 75 4.4 Fas/CD95 membránreceptor expresszió elemzése 76

2. A PRPF40B helyhez szükséges szerkezeti elemek jellemzése 154 3. A PRPF40B kölcsönhatásba lép az SF1 és az U2AF spliceoszómakomponensekkel 65 156 4. A PRPF40B modulálja az alternatív splicingeket 157 5. A PRPF40B részt vesz az apoptózis folyamatában 159 6. A PRPF40B az idegszövetekben és funkciókban különbözõen fejezi ki magát a transzkripció aktivátoraként 159 7. A PRPF40B implikációja az AML-ben 162 8. A PRPF40A és a PRPF40B közötti hasonlóságok és különbségek 164 9. PRPF40B mint transzkripciós és splicelési folyamatok összekapcsolója 165 VIII. BIBLIOGRAPHY 169

Rövidítések Reverz RLU relatív fényegységek fordítása RNAPII RNS polimeráz II RRM RNS felismerési motívum, RNS felismerési motívum s az átlagos Ser2 szerin 2 Ser5 szerin 2 Ser5 szerin 5 SF1 1. Splicing faktor második SEM standard hibája kicsi nukleoláris ribonukleoproteinek SNP egy nukleotid polimorfizmus SRE szabályozó elemek összekapcsolása, szabályozó elemek illesztése TCERG1 transzkripciós megnyúlás szabályozó 1 Th4 treonin 4 TIA-1 T-sejt intracelluláris antigén-1 TNFR tumor nekrózis faktor receptor, tumor nekrózis faktor receptor TSS transzkripció kezdő hely U snrnp uridinben gazdag kis nukleáris ribonukleoprotein U2AF U2 snrnp segédfaktor URE6 uridinben gazdag exonikus 6 elem URI6 uridinben gazdag intronikus 6 elem WB western blot WT vad típusú/vad XIAP X-kapcsolt Apoptózis gátló YBX3 Y box kötő fehérje 3 5

Bevezetés I-2. Ábra. Splicoszóma összeállítása és kötési reakció. Az egyes komplexek (E, A, B, C) képződésének vázlatos diagramja a spliceoszóma összeszerelési szakaszaiban. Az U1, U2, U4, U5 és U6 snrnps alegységek vannak ábrázolva; valamint az SF1 és U2AF illesztési tényezők. 3 SS, 3. illesztési hely (GA); 5 SS, illesztési hely 5 (GU); BPS, elágazási pont helye (A); Py, polipirimidin traktus; ED, az exon meghatározása. 2.2 Az exon meghatározása A spliceoszóma kezdeti összeszerelése során az intron mindkét oldalára faktorok toborzása nem önállóan megy végbe, de olyan kommunikáció van közöttük, amely megkönnyíti az 5 SS és 3 SS hely kölcsönös felismerését. Az intronok nagy mérete az exonok hosszához viszonyítva azonban ezt a kapcsolatot az exon mentén közvetített interakciók révén valósítja meg az exondefiníciónak nevezett folyamatban (Berget, 1995). Ezután az intron meghatározása az intron mentén létrehozott interakciók révén történik, lehetővé téve a spliceoszóma U1 és U2 snrnps alegységeinek, következésképpen a 3 SS és 5 SS helyek megközelítését, ami funkcionális komplexumot eredményez (De Conti, Baralle és Buratti, 2013). 16.

Bevezetés I-9. Ábra. Az apoptózis pályák sematikus ábrázolása. Az extrinsic útvonalat extracelluláris ingerek aktiválják, és egy ligandum (FasL/TNF/TRAIL) az extracelluláris membránreceptorához (Fas/TNFR/TRAIL) történő kötődése és a kaszpázok aktiválása váltja ki. A belső utat intracelluláris jelek aktiválják, amelyek átszervezik a mitokondriális membránt, lehetővé téve a citokróm c kilépését a kaszpáz útvonalat aktiváló citoplazmába. Ezeket a kaszpázisokat gátolhatják az IAF molekulák, amelyeket viszont olyan tényezők szabályoznak, mint a Smac/DIABLO, amikor kilépnek a mitokondriumokból a citoplazmába. Mindkét utat a Bid proteolitikus hasítása köti össze. 7. APoptózis és splicing Az apoptózis folyamatában részt vevő fehérjék sokaságát alternatív splicing szabályozza, ellentétes funkciójú izoformákat generálva, amint ez a Bcl-x és Fas génnél előfordul. A doktori disszertáció érdekében az alábbiakban ismertetjük az alternatív Fas splicing szabályozásának néhány aspektusát. 48

Célkitűzések A doktori értekezés célkitűzései a következők: 1. A PRPF40B biokémiai jellemzése a. A PRPF40B helyének tanulmányozása b. Az eloszlásához és működéséhez szükséges szerkezeti elemek általános elemzése. c. A PRPF40B funkcionalitása szempontjából fontos kölcsönhatások azonosítása. 2. A PRPF40B funkcionális jellemzése a. Határozza meg a PRPF40B szerepét az alternatív illesztési folyamatban. b. A PRPF40B transzkripcióban való részvételének vizsgálata c. A PRPF40B humán transzkriptómban való működésének általános vizsgálata. 59

Anyagok és metódusok

Az anyagok és módszerek az 5. és 7. exonok, beleértve a Fas gén pro-apoptotikus és antiapoptotikus izoformáit. Az amplifikált PCR-termékeket 3,5% -os agarózgélen oldottuk fel. A sávok intenzitását a Quantity One v4.6.5 programmal (Bio-Rad) számszerűsítettük. A kísérleteket három példányban hajtottuk végre. A Fas gén valós idejű PCR-rel történő kvantifikálását iq SYBR Green Supermix (Bio-Rad) alkalmazásával hajtottuk végre az icycler termikus ciklus állomáson (Bio-Rad) az FE6/FE7 oligonukleotidokkal (Tm 53.5ºC), amelyek felerősítik a régiót. a Fas gén 6. és 7. exonja között, amelyek a pro-apoptotikus izoformába tartoznak. Az egyes kísérletek belső kontrolljaként a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) szintjét a GAPDH-F/GAPDH-R oligonukleotidok alkalmazásával mértük. A kísérleteket legalább ötször hajtottuk végre. Az értékek (E Fas) CT (Fas)/(E GAPDH) CT (GAPDH) formában vannak ábrázolva, ahol E a PCR és a CT hatékonyságát jelenti: CT kontroll minta-ct minta probléma. A statisztikai elemzéshez a Prism 5.0 szoftvert (GraphPad) használtuk. A minták közötti átlag összehasonlításához a t-student tesztet alkalmaztuk. A P értékeket a grafikonokon csillagok jelölik (*, P