szempontjából

  • Összegzés
  • Fő
  • ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
  • A vizsgálat résztvevői
  • Vérminták
  • Plazma-aminosav-analízis AAA-val
  • A szárított vérfoltok aminosav-analízise HPLC-vel, fluorometrikus detektálással
  • Az MS/MS tandemszárított vérfoltok aminosav-analízise
  • Étrendi értékelés
  • statisztikai elemzés
  • EREDMÉNYEK
  • VITA

Összegzés

Cél: A fenilalanin monitorozása kritikus fontosságú a fenilketonuria kezelésében. A vér fenilalanin-koncentrációjának mérésére három módszert hasonlítottunk össze: az aminosav-analizátort, a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát fluorometrikus detektálással és a tandem tömegspektrometriát.

Módszerek: 22 fenilketonuriás, 12–48 éves korú beteget vizsgáltunk, akik részt vettek anyagcseretáborunkban. A vért heparinizált csövekbe vettük (aminosav-elemző elemzés céljából) vagy szűrőpapírba (nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás analízishez fluorometrikus detektálással és tandem tömegspektrometriával).

Eredmények: Az aminosav-analizátorral mért plazmában a fenilalanin plazmakoncentrációja szignifikánsan magasabb volt, mint a teljes vérből szűrőpapíron nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (különbség: 102 μM; 95% konfidenciaintervallum: 23, 181) és tandem tömeg mellett. spektrometria (különbség: 137 μM; 95% konfidencia intervallum: 58, 216). A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás és tandem tömegspektrometriás fenilalanin-koncentrációk nem különböztek szignifikánsan (P = 0,5).

Következtetések: A vér fenilalanin-koncentrációjának étrendi megfelelés ellenőrzése során a klinikusoknak figyelembe kell venniük az alkalmazott módszert; A szűrőpapír teljes vérvizsgálata következetesen körülbelül 15% -kal alacsonyabb volt, mint a plazmateszteké.

Fő

A fenilketonuria (PKU) egy veleszületett anyagcsere-hiba, amely egy recesszív genetikai mutáció eredményeként jön létre, általában abban a génben, amely a fenilalanin-hidroxilázt (a fenilalanin (Phe) aminosav (Phe) tirozinná (Tyr) hidroxilálásáért felelős enzim) kódolja. intermedier a neurotranszmitterek termelésében. Ha a PKU-t nem kezelik, a Phe metabolitok felhalmozódnak és a neurotranszmitterek csökkennek, ami mentális retardációhoz, viselkedési rendellenességekhez és rohamokhoz vezet. Ezek a negatív hatások azonban sikeresen megelőzhetők az étrendi kezeléssel, ha az élet első napjaiban kezdődnek, ezért minden állam ma már tartalmazza a PKU-t újszülött szűrőpaneljeiben.

Bár nincsenek univerzális irányelvek, a PKU kezelésének általánosan elfogadott megközelítése szigorú étrend, amely magában foglalja a vér Phe-koncentrációjának a kezelési tartományban tartásához szükséges intakt fehérje mennyiségét és Phe-mentes anyagcsere-képlettel történő kiegészítést. hogy a vér Phe-koncentrációja legalább 6 évig ne haladja meg a 360 μM-t (6 mg/dL; az μM-et mg/dL-re konvertálja, osztva 60-mal). 1 A Phe alacsonyabb koncentrációja társult a normál kognitív képességekkel serdülőknél és felnőtteknél, ami azt jelzi, hogy optimális eredmények érhetők el, ha a Phe-szintet 12-3 évig 120-360 μM-en és onnantól kezdve 120-900 μM-ig tartják. 2 A vér Phe-koncentrációjának szigorú ellenőrzése szintén kritikus a terhesség alatt; egy olyan anyától született gyermek, amelynek PKU-ja nincs metabolikus kontroll alatt, mentális retardációban, mikrokefáliában és veleszületett szívelégtelenségben szenvedhet. 3

Az egész életen át tartó étrend-megfelelés célja a vér Phe-koncentrációjának monitorozásához szükséges egyszerű, gyors és pontos módszerek kritikus igénye. Az újszülöttek PKU-jának egyszerű szűrési módszere, a Guthrie Bacterial Inhibition Assay, 4 már több mint négy évtizede használatos. Azóta számos új módszert fejlesztettek ki, köztük az aminosav-analizátort (AAA), a fluorometriát, az 5 nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC), a 6, 7-et és a tandem tömegspektrometriát (MS/MS). 8, 9 Ezek az új technikák létfontosságúnak bizonyultak az újszülöttek szűrésének pontosságának és sebességének javításában, 10, 11, de kevés tanulmány vizsgálta ezen módszerek érvényességét a koncentrációk kvantitatív elemzéséhez. szükséges a beteg megfigyeléséhez.

A PKU-betegek különböznek az aktív enzim mennyiségétől, az orvosi ételek ízpreferenciájától és az előírt étrend betartásának hajlandóságától. Mindezek a tényezők a kezelést nagyon egyénivé és a monitorozás kritikussá teszik. Az Emory Egyetem Orvosi Genetikai Osztályán rendszeresen látjuk a PKU-s betegeket az anyagcsere klinikákon és az éves nyári táborban, ahol az AAA vért vesz és tesztel. Ezen látogatások között a betegek házi szúrásokat végeznek, vérüket szűrőpapírra foltozzák, és a mintát klinikánkba küldik, ahol azt HPLC-vel vagy újabban MS/MS-rel elemzik. Mivel ugyanaz a beteg valószínűleg AAA és HPLC vagy MS/MS, vagy esetleg mind a laboratóriumainkban jelenleg alkalmazott mindhárom módszer alkalmazásával vizsgálja a vérét, ezért arra voltunk kíváncsiak, hogy összehasonlítsuk az e három módszerrel kapott vér Phe koncentrációkat. Ezért az volt a célunk, hogy elemezzük, hogy a három módszer (plazma AAA és HPLC, valamint szűrőpapír teljes vérfoltok MS/MS) hogyan hasonlít össze a vér Phe koncentrációival.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

A vizsgálat résztvevői

Az Emory Egyetemen működő lányok anyagcseretáborát 1994-ben hozták létre azon serdülők igényeinek kielégítésére, akiknek meg kell birkózniuk a korlátozó étrend fenntartásával és a vérben a Phe kívánatos koncentrációjával. 12 serdülő lányt támadtak meg először, mivel utódaik gyenge metabolikus kontrollja káros hatásokat okozhat; A legújabb táboraink kibővültek, különféle korú nők bevonásával. A táborlakók egy hetet töltenek az egyetemen egy házban, metabolikus kutatók és táplálkozási szakemberek mellett, akik "tábori tanácsadóként" szolgálnak. A tábori tevékenységek magukban foglalják a PKU és az étrendoktatást, a főzőtanfolyamokat, az orvosi ételek elkészítését, az új kiegészítő mintákat és a szociális kirándulásokat. Ehhez az elemzéshez adatokat szereztünk egy 2004-es egyhetes tábor résztvevőitől: 25 lány és nő 12 és 48 év között.

Vérminták

A tábor első és utolsó reggelén a résztvevők ellátogattak az Emory Egyetem Általános Klinikai Kutatóközpontjába (GCRC), ahol megmérték magasságukat és súlyukat. A vért (2-3 ml) heparinált csőbe gyűjtöttük AAA-analízishez, és egy vérgyűjtő csőből származó szűrőpapírra helyeztük HPLC-analízishez MS/MS fluorometrikus detektáló pálcával. A szülők (amikor egy lakóautó 18 évnél fiatalabb volt) vagy a táborlakók a tábor előtt tájékozott beleegyezést adtak, és az összes adatgyűjtést az Emory Egyetem Intézményi Felülvizsgálati Testülete jóváhagyta.

Plazma-aminosav-analízis AAA-val

Az aminosav-analízishez egy on-line kolorimetrikus detektorral felszerelt AAA Beckman 6300-at használtunk, amint azt fentebb leírtuk, 13 kisebb módosításokkal. A plazmamintákat azonos térfogatú 6% szulfosalicilsavval kivontuk és az elemzés előtt 400 μl felülúszót összekevertünk 500 μl B lítium-pufferrel és 100 μL 0,25 mM S-aminoetil-ciszteinnel (SAEC). A mintát Beckman nagyteljesítményű kationcserélő oszlopra (10 × 0,4 cm) injektáltuk, és a szabad aminosavakat Beckman Coulter A, D, E és F lítium pufferek (pH 2, 9 közötti tartományban) kombinációjával választottuk el. 3,9-ig), változó ionerősségű és hőmérsékletű programmal. Ezután az aminosavakat kolorimetriásan mértük 570 és 440 nm hullámhosszakon, miután az oszlopot ninhidrinnel derivatizáltuk. Beckman Standard Mix-ét használtuk kalibrátorként. A mintában jelenlévő aminosavak azonosítására és mennyiségi meghatározására a Beckman System Gold szoftvert használták, azok retenciós ideje és abszorbanciaértékei alapján.

A szárított vérfoltok aminosav-analízise HPLC-vel, fluorometrikus detektálással

Az MS/MS tandemszárított vérfoltok aminosav-analízise

Étrendi értékelés

A táborlakók az első táborozási napot közvetlenül megelőző 3 nap alatt 3 napos étkezési nyilvántartást készítettek, amelyet aztán a Ross AAA szoftverprogram segítségével elemeztünk (3.1 verzió, 1997, Ross Products Division, Columbus, OH).

statisztikai elemzés

Az összes statisztikai elemzéshez SAS-t (9.1 verzió, SAS Institute, Cary, NC) használtunk. Három táborozót kizártunk a hiányos adatok miatt (kora reggeli repüléseik voltak, és elhagyták az egyetemet, mielőtt a GCRC-hez látogattak mérések és vérvétel céljából), így a végső mintanagyság n = 22 volt. Mindhárom módszer esetében mindegyik mintát teszteltük két példányban, és az átlagot használták. A három módszer összehasonlításához kiszámoljuk a legkisebb négyzetek átlagának különbségét (PROC MIXED a SAS-ban), és létrehozunk Bland-Altman különbségtáblákat. 15 P 2 (1. táblázat). Hét táborozót túlsúlyosnak vagy elhízottnak minősítettek (BMI ≥ 25 kg/m 2). A táborba érkezéskor az átlagos energia- és fehérjebevitel 1674 kcal/nap és 59 g/nap, Phe és Tyr bevitele pedig 9,9, illetve 82,4 mg/kg/nap volt.

Teljes méretű asztal

A három módszer összehasonlításakor a legnagyobb legkisebb négyzetek közötti átlagos különbség az AAA és az MS/MS között volt, az átlagos AAA Phe-koncentráció körülbelül 137 μM-rel magasabb, mint az MS/MS (2. táblázat). Az AAA eredmények szintén szignifikánsan magasabbak voltak, mint a HPLC-vel kapott eredmények (102 µM). Nem találtunk szignifikáns különbséget a HPLC és az MS/MS átlagos Phe koncentrációi között.

Teljes méretű asztal

Bland-Altman-számunkban ábrázoljuk a Phe-koncentrációk százalékos különbségét az átlagos Phe-koncentrációkkal szemben. Az AAA-ból nyert Phe-koncentrációk átlagosan 12% -kal voltak magasabbak, mint a HPLC-vel kapottak (1. ábra); kisebb a Phe koncentrációja, úgy tűnik, kisebb a különbség. Az AAA-ból nyert Phe-koncentrációk átlagosan 19% -kal voltak magasabbak, mint az MS/MS-től kapottak (2. ábra). Bár a HPLC és az MS/MS alapján kapott Phe-koncentrációkban nem volt szignifikáns különbség, a különbségtáblázatból kiderül, hogy a mérések átlagosan körülbelül 5% -kal voltak magasabbak a HPLC esetében (3. ábra). Az ábra azt sugallja, hogy bármilyen különbség valamivel nagyobb a Phe alacsonyabb koncentrációinál.

A fenilalanin-koncentráció százalékos különbségének (aminosav-analizátor - nagy teljesítményű folyadékkromatográfia) és a két módszerrel meghatározott átlagos fenilalanin-koncentráció Bland-Altman diagramja. Az átlagos százalékos különbséget a folytonos vonal, a 95% -os határt pedig a szaggatott vonalak jelzik.

Teljes méretű kép

A fenilalanin-koncentráció százalékos különbségének (aminosav-analizátor - tandem tömegspektrometria) és a két módszerrel meghatározott átlagos fenilalanin-koncentráció Bland-Altman diagramja. Az átlagos százalékos különbséget a folytonos vonal, a 95% -os határt pedig a szaggatott vonalak jelzik.

Teljes méretű kép

A fenilalanin-koncentráció százalékos különbségének (nagy teljesítményű folyadékkromatográfia - tandem tömegspektrometria) és a két módszerrel meghatározott átlagos fenilalanin-koncentráció Bland-Altman diagramja. Az átlagos százalékos különbséget a folytonos vonal, a 95% -os határt pedig a szaggatott vonalak jelzik.

Teljes méretű kép

VITA

Jelentős különbségeket találtunk a vér Phe koncentrációiban, amelyet AAA, HPLC és MS/MS mértünk. A plazma AAA-analízissel a legmagasabb a vér Phe-koncentrációja volt; A szűrőpapíros vérmintákat használó HPLC és MS/MS statisztikailag nem különbözött egymástól, és a Phe-koncentrációk következetesen 12% -kal alacsonyabbak voltak a HPLC-nél és 19% -kal alacsonyabbak az MS/MS-nél az AAA-hoz képest. A három módszerrel kapott vér Phe-koncentrációk eléggé különböznek ahhoz, hogy valódi klinikai hatást gyakorolhassanak, mivel a különböző értékek valószínűleg különböző kiigazításokat indítanának el az étrendben vagy az anyagcsere-táplálékban orvos vagy metabolikus dietetikus által, különösen magasabb Phe-koncentrációk esetén.

Ebben az elemzésben három módszert hasonlítunk össze az előkészített és elemzett vérminták (plazma vagy szűrőpapír) felhasználásával, amelyet laboratóriumaink Phe-koncentrációjának nyomon követésére használunk; Nem hasonlítottuk össze a plazma és a teljes vér elemzését szűrőpapíron ugyanarra a módszerre. Ezenkívül szűrőpapírból származó vérmintáinkat az egyes lakóautókból vett vénás vérmintákból, nem pedig az ujjlenyomatokból vettük fel; ezért ezek a minták nem tökéletesen reprezentatívak azokhoz, amelyeket rutinellenőrzés céljából postáznának nekünk. A vénás mintákat csak azért választottuk, hogy elkerüljük a táborozóink szükségtelen stresszét az extra botok miatt, valamint hogy biztosítsuk a szűrőpapír teljes és következetes vérrel való telítettségét.

Elemzésünket egy PKU-ban szenvedő lányok és nők viszonylag nagy mintája erősítette, akiktől az éhomi vérmintákat gyűjtötték és két időpontban közvetlenül megfigyelték szűrőpapíron az Általános Klinikai Kutatóközpontban képzett phlebotomisták. Eredményeink hangsúlyozzák annak szükségességét, hogy azok, akik részt vesznek a Phe-koncentrációk monitorozásában, tisztában kell lenniük az alkalmazott módszertannal, mint a kapott eredmények. További kutatásokra van szükség a plazma Phe-koncentrációjának mennyiségi meghatározásához a teljes vérhez képest szűrőpapíron e különböző módszerek alkalmazásával; A PKU-betegekkel foglalkozó orvosok és metabolikus táplálkozási szakemberek számára iránymutatások kidolgozásához elengedhetetlen a Phe monitorozásának analitikai módszereiben mutatkozó különbségek jobb megértése.