Összegzés
Itt leírunk egy egyszerű, olcsó és gyors tisztítási módszert az emberi és egér fehér zsírszövet 3D-s szerkezetének feloldására markerek kombinációjával az érrendszer, az atommagok, az immunsejtek, az idegsejtek és a lipidcseppréteg-fehérjék fluoreszcens képek felhasználásával történő megjelenítésére.
Absztrakt
Bevezetés
Az elhízást a zsírszövet tömegének növekedése jellemzi, és világszerte jelentős közegészségügyi problémává vált, mivel az elhízott emberek fokozottan veszélyeztetettek a szív- és érrendszeri betegségek, a 2-es típusú cukorbetegség, a májbetegségek és a rák egyes típusainak kialakulásában.
A zsírszövet alapvető fiziológiai funkciója az egész test glükóz- és lipid homeosztázisának modulálása 1, 2. A táplálkozási időszak alatt az adipociták (vagyis a zsírszövet fő sejtjei) az étkezés által biztosított glükóz- és lipidfelesleget trigliceridekben tárolják. A koplalás során az adipociták a triglicerideket észteresítetlen zsírsavakká és glicerinné bontják, hogy fenntartsák a test energiaigényét. Az elhízás kialakulása során a zsírszövet kitágul, növelve az adipociták 1 méretét (hipertrófiája) és/vagy számát (hiperpláziája), hogy növelje annak tárolókapacitását. Amikor a zsírszövet expanziója eléri a határértéket, a betegek körében nagyon változó állandó, a fennmaradó lipidek felhalmozódnak más anyagcsere-szervekben, beleértve az izmokat és a májat 3, 4, ami funkcionális kudarcukhoz vezet, és ezzel összefüggő kardio-metabolikus komplikációkat indít el. 1, 5. Ezért kulcsfontosságú klinikai kihívás a zsírszövet tágulását szabályozó mechanizmusok azonosítása.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Ezt a protokollt tesztelték és validálták az összes egérlerakódásra és az emberi fehér zsírszövetre. Az emberi és egér zsírszöveteket az európai törvényeknek megfelelően gyűjtötték össze, és a francia és a svéd etikai bizottság jóváhagyta.
1. Az egér és az emberi fehér zsírszövet rögzítése
2. Az egér és az emberi fehér zsírszövet permeabilizálása és telítettsége
3. Festési eljárás egér és emberi fehér zsírszövet esetében
4. Az egér és az emberi fehér zsírszövet tisztítási eljárása
5.3. Átlátszó fehér zsírszövet D-konfokális képalkotása
- Vigye át a szövetet egy üvegfenékkel ellátott fém képalkotó kamrába (lásd Anyagtáblázat)vegyi fedél alatt, és töltse fel a kamrát friss metil-szaliciláttal.
MEGJEGYZÉS: Annak érdekében, hogy rögzítse a szövetet a helyén, és megakadályozza, hogy a kamrában lebegjen vagy oldalra mozduljon, helyezzen el több 18 mm-es kerek üveg fedőlemezt (lásd: Anyagtáblázat)a szövet tetején, ha a fényképezőgépre szerelik. - Helyezze a képkamerát egy fordított konfokális mikroszkópra.
- Képezze le a szövetet kis nagyítású objektív segítségével (pl. 4x objektív), hogy néhány cm 3 -es 3D térképet készítsen az összes zsírszövetről vagy az emberi szövetmintáról.
- Válasszon több területet a szövetmintavételhez nagyobb nagyítással. Jellemzően használjon 20-szoros távolsági légobjektívet, amely jó felbontás-mélység arányt biztosít. Nagy mozaikképeket szerzünk, z-halmokkal 600 és 2000 m között.
MEGJEGYZÉS: Használjon nagy távolságú lencsét a szövetbe.
6. Kvantitatív eredmények kivonása 3D zsírszövet képekből
MEGJEGYZÉS: A különböző struktúrák szegmentálása és az azt követő kvantitatív információk kinyerése az 5. pontban létrehozott 3D-s képekből a sok létező képelemző szoftver opciójának bármelyikével elvégezhető, akár kereskedelmi, akár ingyenes. A következő pontokban leírjuk a laboratóriumunkban általánosan alkalmazott stratégiát, amely kereskedelmi szoftverek segítségével kvantitatív információkat nyer ki 3D zsírszövet képekből (lásd: Anyagok táblázat).
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
Az itt leírt és az 1. ábrán összefoglalt eljárás segítségével,képesek voltunk optikailag megfesteni és megtisztítani az emberi és az egér fehér zsírszövetét a 2A. ábra szerint és a 2B,illetőleg. Az átlátszó szövetet átvittük a fém képalkotó kamerába konfokális képalkotás céljából (3A. Ábra). A kiürülés drámai módon javította a szövetképek mélységét, amelyeket megszerezhettünk (3B. Ábra és 3C. ábra). Az összes zsírszövet 3D-ben megszerezhető kis nagyítással, négyszeres objektív alkalmazásával (lásd Kiegészítő film 1),3D térkép előállítása, amely lehetővé teszi a különböző nagyítási nagyítású területek kiválasztását 20x objektív segítségével (3D ábra). A nagy nagyítású képek 3D-ben, 2 mm mélységgel készülnek (3E ábra).
1. ábra: A fehér zsírszövet eltávolítási eljárásának összefoglalása. A fehér vagy egér zsírszövetek fixek, permeabilizáltak, telítettek, foltosak és tisztaak. A képeket 3D-ben gyűjtik, és kereskedelmi szoftverekkel elemzik. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
2. ábra: Fehér zsírszövet fényképei. (NAK NEK) Az emberi fehér abdominopelvicus zsírszövet fényképe a fehérítési eljárás előtt és után. (B) Az egér epididmikus fehér zsírszövetének fényképe a tisztítási eljárás előtt és után. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
5. ábra: 3D képelemzés kereskedelemben kapható szoftverek segítségével (lásd az anyagtáblázatot). (NAK NEK) A szegmentált humán adipociták 3D-s térfogatának megjelenítése 3D-ben, kereskedelemben kapható szoftverekkel. Minden adipocita más színű, mint a szomszédos érintkezésben lévő adipociták. A konténerek piros színnel vannak feltüntetve. (B) Az adipociták mennyiségi meghatározása és méreteloszlása az A panel 3D térfogatábrázolásából, amely körülbelül 20 000 adipocitát tartalmaz. (C) A 3D-ben szegmentált erek 3D-s térfogatának ábrázolása a kereskedelemben kapható szoftverek segítségével, a piros és a sárga pedig a nagy, illetve a kis erek esetében. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
1. kiegészítő film: Az összes szubkután fehér zsírszövet 3D-s volumenmegjelenítése a 3D-s ábrán. A fehér doboz 2 cm 3 -es kockát képvisel. A videó letöltéséhez kattintson ide.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Közzétételek
A szerzőknek nincsenek nyilvánosságra hozható konfliktusaik.