Az enzim-szubsztrát kapcsolat hatása a szarvasmarha-tejsavó enzimatikus hidrolízisére az Alcalasa® 2.4L segítségével
Az enzim-szubsztrát kapcsolat hatása a szarvasmarha-tejsavó enzimatikus hidrolízisére az Alcalasa® 2.4L segítségével
Omar A. Figueroa 1
Sandy P. Peñaloza 2
1 Mérnöki Kar, Agrotechnikai Tanszék, Universidad de la Guajira, Km 5 Vía Maicao, Riohacha, -Kolumbia. (e-mail: [email protected])
2 Mérnöki Kar, Agrotechnikai Tanszék, Univ. Popular del Cesar, Diagonal 21 No. 29-56 Valledupar-Colombia. (e-mail: [email protected]; [email protected])
3 Gyógyszerészeti és Élelmiszer-tudományi Kar, Élelmiszer-tanszék, Univ. De Antioquia, Calle 70 # 52-21, Apartado Aéro 1226, Medellín, Kolumbia. (e-mail: [email protected])
A vizsgálat célja az antioxidáns kapacitás (FRAP és ABTS módszerrel mért) és a vas kelátképző képességének elemzése volt az idő függvényében különböző enzim és szubsztrát körülmények között. A porított szarvasmarha-savó enzimatikus hidrolízisét szakaszos reaktorban hajtották végre, 0,5 l kapacitású és állandó hőmérsékletű reaktorban. A legnagyobb aktivitású hidrolizátumokat molekulaméretük szerint elválasztottuk> 100, 10-100, + alacsony arányban. A hidrolízis mértékének növekedése kedvez az ABTS módszerrel mért antioxidáns aktivitásnak, valamint a hidrolizátumok vas-kelátképző aktivitásának.
Kulcsszavak: enzimatikus hidrolízis; savó; alcaláz; fehérjék; antioxidáns peptidek
A tanulmány fő célja az antioxidáns kapacitás (FRAP és ABTS módszerrel mért) és a vas kelátképző képességének elemzése volt az idő függvényében különböző enzim- és szubsztrátkörülmények között. A szarvasmarha tejsavópor enzimatikus hidrolízisét szakaszos reaktorban, 0,5 l kapacitású és állandó hőmérsékletű reaktorban hajtottuk végre. A legaktívabb hidrolizátumokat molekulaméretük szerint választották szét> 100, 10-100, + kation alacsony alacsony szubsztrátok esetén. A hidrolízis fokának növekedése kedvez az ABTS módszerrel mért antioxidáns aktivitásnak és a hidrolizált fémek kelátképző aktivitásának.
Kulcsszavak: enzimatikus hidrolízis; tejsavófehérjék; alcaláz; fehérjék; antioxidáns peptidek
Különböző vizsgálatok igazolták a kapcsolatot a peptidek biológiai aktivitása és molekulatömege között. Különösen az 1–4 kDa közötti molekulatömegű peptidfrakciók lennének a legérdekesebbek táplálkozási és/vagy gyógyszerészeti felhasználásra (Saidi et al., 2014). Az ultra- és a nanoszűrés egyaránt olyan technológia, amelyet viszonylag sikeresen alkalmaznak a bioaktív hatású peptidek hidrolizált tejfehérjékből, szójababból és növényi szubsztrátokból történő megtisztítására (De Castro és Sato, 2015). Az enzimatikus fehérje-hidrolízis reakció bonyolult főleg a következők miatt: i) a szubsztrátok változatos és gyakran ismeretlen jellege (a különböző fehérjék primer és tercier szerkezete), ii) a reakció előrehaladtával új hidrolízis szubsztrátok képződése, iii) rövid peptidek és szabad aminosavak, amelyek komoly gátlást okoznak. iv) az enzim inaktiválása az idő múlásával (Valencia és mtsai, 2015), és v) a kötések eltérő reaktivitásával járó hatások az alkalmazott enzimhez képest, valamint hozzáférhetőségük a specifikus reakcióhelyekhez (harmadlagos szerkezet és kvaterner fehérjék) (Fernández és Riera, 2013).
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
Ezután a reakciórendszerek kontrolljával, az alkalmazott analitikai módszerekkel és az alkalmazott kísérletek tervezésével kapcsolatos elemeket ismertetjük.
Reakciórendszer
A hidrolízist egy 0,5 liter űrtartalmú üvegreaktorban hajtottuk végre, a hőmérséklet szabályozására szolgáló vizes cirkulációs köpennyel, egy MX07R-20 termosztatikus szabályozóval ellátott keringőfürdőhöz (Thomas Scientific, USA ± 0,07 ° C) csatlakoztatva. A pH-érték szabályozásához és a reakció hőmérsékletének rögzítéséhez kombinált üveg elektródot használtunk, rögzített membránnal, egy számítógéppel (Tiamo 1.2.1 szoftver) működtetett Titrando 842 automata titrátorhoz (Metrohm, Svájc) csatlakoztatva. A reakcióközeget 801-es mágneses keverővel (Metrohm, Svájc) 400 fordulat/perc sebességgel folyamatosan keverjük. A rendszer hőmérsékletét és pH-ját állandóan tartottuk 61 ° C, illetve 9 értékkel.
Szarvasmarha tejből porított tejsavót használtak fel, amelyet Bogotá-Kolumbia városának kereskedelmi beszállítójától szereztek be, 12% -os bejelentett fehérjetartalommal. Ezeket az adatokat Kjeldahl-módszerrel (AOAC 2005, 954.01) támasztották alá, a fehérjetartalom becsléséhez konverziós tényezőként 6,38-at használtak. Az enzim megfelel az Alcalasa® 2,4 L (2,4 AU-A/g) élelmiszeripari minőségű (Novozymes, Dánia) kereskedelmi készítményből származó Bacillus licheniformis endoproteázának.
1. ábra. A kísérletben alkalmazott hidrolízis reakciórendszer vázlata.
Enzim hidrolízis folyamata
A reakciót pH-stat módszerrel szabályozott enzimatikus hidrolízissel hajtottuk végre, amelyet egyszerűsége miatt az enzimatikus hidrolízis során a legtöbbet elismertnek tekintenek (Rutherfurd, 2010), amely a pH állandó megtartásából áll bázis vagy híg sav hozzáadásával. Ebben az esetben, mivel lúgos reakcióról van szó, 1 M NaOH-t alkalmaztak. Elvileg a hozzáadott bázis a pH állandó tartása érdekében csak a fehérjék és peptidek lúgos pH-jú amidkötésének lebontása során felszabaduló protonokat semlegesíti. helyébe az alap kationja lép; így a hidrolízissel keletkező protonok ekvivalensek a hozzáadott bázis móljaival (Adler-Nissen, 1986). A GH becslést az (1) egyenlet felhasználásával készítettük.
Ahol: h = hidrolizált peptidkötések száma; Htot = a fehérjeszubsztrátban lévő peptidkötések száma (egyenérték/kg); VNaOH = az összes NaOH térfogata (L), Nb = a bázis normalitása, Mp = a fehérje tömege (kg-ban), GH = a hidrolízis mértéke.
A reakcióban felszabaduló α-NH2 csoportok disszociációjának mértékét, az α-t közvetlenül a (2) egyenletből számoljuk ki, és függ a működési pH-tól és a pK-tól. Ez utóbbi a reakció hőmérsékletétől függően jelentősen változik, és a (3) egyenlet alapján megbecsülhető (Salazar et al., 2012). Számított 0,992 α-értéket használtunk, és 8,8 meq/g htot-t jelentettek a tejsavófehérjék esetében (Adler-Nissen, 1986).
Ahol: α = a fehérje disszociációs foka és T = üzemi hőmérséklet Kelvin fokban.
Tervrajz
Az elemzés során az E0 (150, 300 és 600 mg/l) és az S0 (5,10, 10,20 és 20,40 g/l) hatását a reakcióidő alatt (0-120 perc) ellenőriztük az antioxidáns kapacitásra in vitro (ABTS és FRAP) és a vas kelátképző képesség (CQFe). A különböző függő változók evolúciójának összehasonlító elemzését két kísérleti csoportban végeztük: A) az S0 változása és az E0 állandó tartása; B) az S0 állandó és változó E0 tartása, az 1. táblázat szerint. A szubsztrátkoncentráció szintje egybeesik a Km-értékhez közeli régióval, ahol a kezdeti hidrolízis sebessége jelentős, a telítettségi görbében. Míg a felhasznált enzimszinteket korábbi publikálatlan tesztek határozták meg. Az elemzés során ismételt mérésekhez ANOVA-t alkalmaztunk egyénen belüli tényezővel (idő: 0, 10, 20,75 és 120 perc) és egy alanyok közötti faktorral (S0 vagy E0 minden kísérlethez), szignifikancia-statisztikával. 0,05. Minden hidrolízist a tervezés által meghatározott körülmények között három példányban hajtottunk végre.
A hidrolizátum bioaktív potenciálja
A jelzett időpontokban mintákat vettünk, ami különböző mértékű hidrolízist jelent. A mintákat 10 percig 90 ° C-on tettük alá enzimatikus dezaktiválás céljából, majd -20 ° C-on fagyasztottuk, hogy később felhasználjuk az értékelt antioxidáns aktivitások in vitro elemzéséhez.
1. táblázat: Munkakörülmények (a kontrollváltozók és a függő változók szintje) az elvégzett kísérletekhez: A) változó szubsztrát és B) variábilis enzim.
Az antioxidáns aktivitás meghatározása ABTS segítségével
Re és munkatársai által leírt módszer szerint hajtották végre. (1999), amelyben 100 μl mintát vagy Trolox standardot kevertünk 1000 μL ABTS oldattal. Ezután szobahőmérsékleten inkubáltuk 30 percig. Az abszorbanciát 730 nm-nél rögzítettük egy Genesys ™ 10S UV-Vis UV-Vis spektrofotométerrel (Thermo Scientific, USA), standardként 0-200 µM koncentrációjú Trolox oldatot használva. Az eredményeket mikromol Trolox ekvivalensben fejeztük ki fehérje grammban (μmol ET/g).
Az antioxidáns aktivitás meghatározása FRAP
Pulido és munkatársai által leírt módszertan határozta meg. (2000), 900 µL FRAP reagenst (TPTZ, FeCl3 és 3M acetátpufferrel) összekevertünk 90 µl desztillált vízzel és 30 µl mintával vagy Trolox standarddal, és 37 ° C-on, száraz fürdőben 30 percig inkubáltuk. min. Az abszorbancia növekedését 595 nm-nél Genesys ™ 10S UV-Vis spektrofotométerrel (Thermo Scientific, USA) mértük nátrium-acetát-puffer vakpróba alkalmazásával. 0-300 µM koncentrációjú Trolox-oldatot használtunk standardként. Az eredményeket mikromol Trolox-ekvivalensben fejezzük ki fehérje grammban (μmol TE/g fehérje).
Vas-kelátképző tevékenység
A Decker és Welch (1990) által leírt módszert alkalmaztuk, némi módosítással. 1 ml mintát összekeverünk 20 µl 2 mM FeSO4 • 7H2O oldattal. Az elegyet keverjük, majd 5 percig állni hagyjuk. Hozzáadunk 40 ul 5 mM ferrozin-oldatot, és erőteljesen keverjük. 10 percig vártuk, és az abszorbanciát 562 nm-nél leolvastuk. A kelát-százalékot a 4. egyenletnek megfelelően számoltuk.
A peptidfrakciók tisztítása ultracentrifugálással (UF)
A legmagasabb antioxidáns aktivitást mutató tejsavó-hidrolizátumokat ultraszentrifugálással koncentráltuk Amicon Ultra-15 ultraszűrő csövekkel (Merck Millipore, Németország), PLHK Ultracel-PL membránokkal, 15 ml térfogattal és 100 molekulatömegű vágással, 10 és 3 kDa. 5000 x g-vel 20 percig centrifugáltuk őket egy Model U-320 centrifugában (BOECO, Hamburg, Németország). Négy frakciót kaptunk (> 100 kDa; 10-100 kDa; 2. ábra: A kezdeti sebesség inverzének grafikus ábrázolása a szubsztrátok különböző koncentrációinál (1-32 g/l) Lineweaver-Burk szerint.
Az eredmények egy enzimatikus telítési rendszer tipikus viselkedését regisztrálják anélkül, hogy bizonyítanák a szubsztrát által gátolt hatásokat az értékelt koncentrációtartományokban, amint azt a Lineweaver-Burk kettős reciprok grafikonja mutatja (2. ábra). Az LSB-Alcalasa® 2,4 L reakciórendszerhez 0,00218 mmol/perc Vmax-értéket és 10,22 g/L Km-értéket kaptunk, amelyeket szignifikáns meghatározási együtthatóval (R 2 = 0,968) kaptunk.
Az enzim és a szubsztrát hatása az antioxidáns potenciálra
A Km érték az Alcalasa® 2,4 L és a szubsztrát közötti affinitás mértékét jelenti, ezt a szubsztrátkoncentrációt vettük referenciaként az enzimkoncentráció antioxidáns aktivitásra (FRAP és ABTS) gyakorolt hatásának elemzésére különböző hidrolízis időkben (Exp B).
A 2. táblázat a különböző statisztikai tesztek p-értékeit mutatja. A többváltozós elemzés eredményeiben a négy statisztika: Pillai nyom, Wilks 'Lambda, Hotelling nyom és Roy fő gyökere azt jelzi, hogy az időfaktor szignifikáns (p 20%).
2. táblázat: Ismételt mérések időben történő vizsgálata változó szubsztráttal (Exp A) és változó enzimmel (Exp B) végzett kísérletekhez, válaszként ABTS és FRAP kapacitással.
Ismeretes, hogy az Alcase 2,4 L-vel végzett hidrolízis kedvez a fehérjék antioxidáns képességének. Amint azt számos mű bemutatta, a GH idővel növekszik, és ugyanúgy javul az antioxidáns kapacitás (Bah és mtsai, 2015). Ez azért van, mert az antioxidáns aktivitás elsősorban az alacsony molekulatömegű peptideknek tulajdonítható, és valamilyen módon a GH általános, mint közvetett eszköz a hidrolizátumok molekulatömegének eloszlásának leírására, míg az elhúzódó hidrolízis felesleges. fokú hidrolízis és ezért sokkal kisebb peptidméretek (Morales et al., 2017). Az eredmények összhangban vannak ezzel az elemzéssel, azonban az adatok egyetértenek abban, hogy ez az antioxidáns aktivitás nem feltétlenül azonos a hasonló GH-értékű frakciók esetében, amelyeket különböző szintű kombinációkkal érnek el.
Antioxidáns aktivitás és GH-k szubsztráttal és változatos enzimmel történő reakcióban
Másrészről, amikor a kezdeti működési szubsztrátkoncentráció megváltozik, megjegyezhetjük, hogy az ABTS és FRAP antioxidáns aktivitások eltérő viselkedéssel bírnak, amint azt a 4. (A és B) ábra mutatja. Az ABTS esetében 75 perc múlva az µmolTE/gramm fehérje (800-nál magasabb) bizonyítható a közepes és a magas szubsztrátszint közötti különbségek nélkül (4A. Ábra). Vagyis az alacsony szubsztrátkoncentrációkkal végzett művelet, annak ellenére, hogy a GH-k idővel viszonylag nagyobb evolúciót mutatnak, és még magasabb végső GH-ket is elérnek, nem kielégítő az ABTS + kationok semlegesítésére képes peptidfrakciók előállításához. A 4B. Ábrán látható FRAP esetében megfigyelhető, hogy az összes hidrolizátum a legmagasabb szubsztrátszinttel, és a végidőnek megfelelő hidrolizátum közepes és alacsony szinten nagyobb volt, mint 400 µmolTE/gramm fehérje; kielégítő értékek, ha figyelembe vesszük, hogy a módszer nem méri az SH csoportokat tartalmazó antioxidánsokat, például néhány aminosavat, mivel ezek nem csökkentik hatékonyan a Fe 3+ -ot Fe 2-re+ .
3. ábra: Antioxidáns aktivitás (A) ABTS és (B) FRAP segítségével mérve szarvasmarha-savóban különböző koncentrációjú enzim (E0) Vs. GH mellett, S0 értéke 10,22 g/L.
Seo és mtsai. (2015) szerint a plazmafehérje-hidrolizátumokból szabad gyökök befogásának képességét számos mechanizmus magyarázza: hidrogén adományozásának képessége, a gyökök stabilizálása, prooxidáns fémionok elkülönítése és valószínűleg egy fizikai aminosav kialakítása a zsírcseppek körül. . Saiga et al. (2003) szerint ez az antioxidáns kapacitás számos aminosav, például tirozin, triptofán, metionin, lizin, hisztidin és cisztein létezésével függ össze; Azonban nemcsak ezen aminosavak jelenléte lehet elegendő az aktivitás kimutatásához, hanem befolyásolják a peptidek elsődleges szerkezetét és aminosav-szekvenciáját is.
4. ábra Az antioxidáns aktivitás alakulása (A) ABTS és (B) FRAP módszerrel mérve szarvasmarha-savóban különböző szubsztrátkoncentrációk esetén (S0) vs. GH, E0 értéke 300 mg/L.
Butré és mtsai. (2012) megállapította, hogy az azonos GH-val rendelkező hidrolizátumok esetében a szarvasmarha-savó 1% -ának hidrolizátumai kevesebb intakt fehérjét tartalmaznak, mint a nagyobb szubsztrátkoncentrációval előállított hidrolizátumok, mert az enzim fehérjéhez való affinitása meghatározza a natív fehérje közötti egyensúlyt és amely megoldásban van telepítve (Deng et al., 2018). Ennek az egyensúlynak a változásai a hidrolízis mechanizmusainak megváltoztatására utalhatnak. Kimutatták, hogy az intakt fehérje affinitása eltérő volt az Alcalase-nal végzett hidrolízis során a különböző szubsztrátkoncentrációk esetében, vagyis ezeknek a hidrolizátumoknak az összetétele eltérő volt, és valójában ezt az enzim szelektivitásának változása változó körülmények között váltotta ki. művelet (Butré et al., 2012). Ez magyarázhatja egyrészt a különböző GH-khoz mért antioxidáns aktivitások különbségeit a szubsztrát különböző szintjein.
Vas-kelátképző tevékenység
5. ábra: Kelátképzési százalék és% GH. A szubsztrátum koncentrációja 10,22 g/l, 300 mg/l enzim alkalmazásával
Antioxidáns peptidfrakciók koncentrációja
3. táblázat: Az S0 = 10,22 g/l hidrolízist követően ultraszűréssel kapott frakciók és a "B" kísérletben alkalmazott enzim alacsony és közepes szintjeinek összehasonlítása
Az LSB és Alcalase enzimatikus hidrolízis reakciójában az idő jelentősen befolyásolja a tejsavó-hidrolizátumok antioxidáns potenciálját. Ezenkívül az antioxidáns aktivitás magasabb alacsonyabb enzimkoncentrációk esetén. Különböző enzimszintek mellett a GH növekedése kedvez az ABTS módszerrel mért antioxidáns aktivitásnak, valamint a hidrolizátumok fém-kelátképző aktivitásának. Másrészről, ennek a reakció rendszernek az alacsony szubsztrátkoncentrációval történő működése ellenére, annak ellenére, hogy idővel jobb teljesítményt mutat a GH-k tekintetében, még a végső GH-k elérése is, amelyek viszonylag magasabbak, mint a többi szubsztrátszint mellett, a peptidvegyületek nem rendelkeznek nagy lehetőség rejlik az ABTS + kationok semlegesítésének képességében. Az FRAP által mért aktivitás esetében az összes hidrolizátum, amely a legmagasabb szubsztrátszinttel ért el, és a végidőknek megfelelő, közepes és alacsony szinten nagyobb volt, mint 400 µmolTE/gramm fehérje, ami kielégítő.
AOAC = Hivatalos Analitikai Kémikusok Egyesülete.
FRAP = a vas redukciójának antioxidáns ereje.
ABTS = azinobisz-3-etil-benzotiazolin-6-szulfonsav.