| В В | В |
Testreszabott szolgáltatások
Magazin
- SciELO Analytics
- Google Tudós H5M5 ()
Cikk
- Spanyol (pdf)
- Cikk XML-ben
- Cikk hivatkozások
Hogyan lehet idézni ezt a cikket - SciELO Analytics
- Automatikus fordítás
- Cikk küldése e-mailben
Mutatók
- Idézi SciELO
Kapcsolódó linkek
- Hasonló a SciELO-ban
Részvény
Journal of Veterinary Research of Peru
verzióВ nyomtatva ISSN 1609-9117
Tiszt. Investiga. állatorvos. Peru v.23В n.3В LimaВ 2012. augusztus
Polimeráz láncreakció alkalmazása a dél-amerikai tevefélék ivarzásához
Vanya Montenegro V. 1, Lenin Maturrano H. 1,2,3, Jane C. Wheeler 2, Raєl Rosadio A. 1,2
A vizsgálat célja egy olyan PCR-technika kidolgozása volt, amely meghatározta a dél-amerikai tevék (CSA) nemét, vér- és ürülékmintákból származó cink ujjfehérje (ZF) szekvenciák, valamint alpaka embriók sejtjeinek felhasználásával. Összesen 28 alpaka, láma és vicu ± a vérmintát, 20 vicu ± a és guanaco székletmintát, valamint 22 alpaka embriót alkalmaztunk 72 és 96 óra között a posztkopula után. A székletmintákat és az embriómintákat 96% -os, illetve 70% -os etanolban tartósítottuk. A vérből és a székletből DNS-t nyertek ki kereskedelmi készletekkel. Három módszert (forralás, proteináz K és fenol-kloroform) alkalmaztunk a DNS kivonására alpaka embriókból. A DNS elemzésére két PCR-technikát fejlesztettek ki: multiplexet (széklet- és vérminta-DNS-hez) és heminesztált PCR-t (embriósejt-DNS-hez). A multiplex PCR pontosan meghatározta a nemet a vérből kivont DNS-minták 100% -ában, a friss ürülékből kivont minták 87,5% -ában és a 4 éves székletminták 50% -ában. A hemesztelt PCR-t azonban nem sikerült optimalizálni.
Kulcsszavak: DNS, PCR, ivarzás, dél-amerikai teve
BEVEZETÉS
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
DNS-minták beszerzése
DNS kivonása a vérből
DNS-kivonás a székletből
DNS-kivonás embriókból
DNS mennyiségi meghatározása
Az összes mintából kivont DNS koncentrációját és tisztaságát spektrofotometriával határoztuk meg 260 és 280 nm-en. A DNS minőségét elektroforézissel igazoltuk agarózgélen.
Az optimalizálási folyamat a vér DNS-ben abból állt, hogy az emlősökben a nagymértékben konzervált ZF gén különböző méretű szegmenseit három primer felhasználásával amplifikálták (Aasen és Medrano, 1990). A protokollok a ZFX2 és ZFX4 primereket használták fel mindkét nemi kromoszómán (ZFX és ZFY) jelen lévő 250 bázispár (bp) szegmens felerősítésére, és egy harmadik fordított ZFY2-t, amelyet a ZFX2 primerrel együtt használtak, csak 130 bp szegmens amplifikálására az Y kromoszómán (ZFY) (Montenegro et al., 2007).
Az erősített töredékek felbontása
Mindegyik PCR termékét 2% -os agarózgélen elemeztük TBE 0,5X pufferoldatban (Tris, bórsav, EDTA), vízszintes elektroforézis kamrában és molekulatömeg-markerrel együtt, hogy meghatározzuk az amplifikált fragmensek méretének közelítő értékét. . A PCR termékeket etidium-bromiddal festettük, transzilluminátoron tettük láthatóvá és Polaroid kamerával fényképeztük (DS 34).
Az eredmények értelmezése
Azokat az állatokat, akiknek a mintái csak egy 250 bp-os PCR-termék (ZFX-Y) amplifikációját mutatták, nőstényként diagnosztizálták, és azokat, amelyek két egyidejű amplikonot mutattak, az egyiket a 250 bp-os (ZFX-Y) és a másikat 130 bp-os (ZFY), diagnosztizálták. mint hímek.
Eredmények és vita
Az alpakák és a lámák véréből kivont DNS-nek magas volt a koncentrációja (45-201 ng/μL) és jó a tisztasága (> 1,8 és a lebomlás minimális jelenléte), ami megerősíti a többi faj esetében közölt hasonló jellemzőket (Chu et al., 2006). A vadállatok vér DNS-je szintén magas koncentrációjú (39–211 ng/μL) és jó tisztaságú (> 1,8) volt (4. táblázat).
Az egyes ZFX és ZFY szegmensek sikeres amplifikációját egyetlen PCR-ben, valamint a ZFX és ZFY szegmensek együttes detektálását többszörös PCR-ben az 5. táblázat részletezi. A ZFY optimális amplifikációját 52 ° C beállítási hőmérséklet alkalmazásával érték el. és 1,6 mM Mg-koncentráció és szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) 1,2 μg/μL, amelyek lehetővé tették a jó termék felerősödését legfeljebb 25 ng DNS-t tartalmazó mintákban. A ZFX-Y szegmens optimális amplifikálásához 64 ° C hőmérsékletre volt szükség 2,7 mM Mg-koncentrációval és 0,8 μg/μl BSA-koncentrációval, amely szükséges ahhoz, hogy látható termékeket kapjunk mintákban, amelyekben több mint 0,1 ng DNS van.
A többszörös PCR optimalizálása céljából kiértékelt körülmények azt állapították meg, hogy mindkét szegmens optikai amplifikálásához a következő feltételeket kellett alkalmazni: 53 ° C beállítási hőmérséklet, 2,5 mM Cl2Mg, 1% BSA, 1% formamid, 50 pmol ZFX2 primer, 12,5 pmol ZFX4 és 25 pmol ZFY2 (5. táblázat). Ezekkel a feltételekkel jó termékeket lehetett elérni akár 20 ng DNS-koncentrációban.
IDÉZETT IRODALOM
1. Aasen E, Medrano JF. 1990. A ZFY és ZFX gének amplifikációja a nemi azonosításhoz emberekben, szarvasmarhákban, juhokban és kecskékben. Biotechnology 8, 1279-1281.
3. Chu J, Lin Y, Wu H. 2006. A non-invazív, mintavétel alkalmazhatósága tajvani mákák (Macaca cyclopis) populációs genetikai vizsgálatában. Taiwania 51: 258-265.
4. Deuter RS, Pietsch, Hertel S, Müller O. 1995. Eljárás széklet DNS előállítására alkalmas PCR. Nucleic Acids Res 23, 3800-3801.
5. GarcA-Muro E, Aznar MP, Rodellar C, Zaragoza P. 1996. Nemspecifikus PCR/RFLP-k a kutya ZFY/ZFX lokuszokban. Anim Genet 28: 150-158.
7. Lemos DC, Lopes Ríos AF, Caetano LC, Lobo RB, Vila RA, Martelli L, Takeuchi PL, Ramos ES. 2005. A TSPY gén alkalmazása a szarvasmarhák ivaroztatására. Genet Mol Biol 28, 117-119.
9. Novoa C, Franco E, García W, Pezo D. 1999. Gonadotropin adag (eCG és hCG), szuperovuláció és embriók megszerzése alpákokban. Rev Inv Vet, Peru 10 (1): 48-53.
10. Nsubuga AM, Robbins MM, Roeder AD, Morin PA, Boesch SC, Vigilant L. 2004. A majomszékletből kivont genomi DNS mennyiségét és a ventilátor azonosítását befolyásoló tényezők javított egyszerű tárolási módszer. Mol Ecol 13, 2089-2094.
11. Ortega J, Franco M, Adams BA, Ralls K, Maldonado JE. 2004. Megbízható neminvazív módszer a nemek meghatározására a veszélyeztetett San Joaquin kit róka (Vulpes macrotes mutica) és más kanidákban. Conserv Genet 5: 715-718.
12. Phua A, Abdullah R, Mohamed Z. 2003. PCR-alapú nemi meghatározási módszer a kecske nemének szelekciójában való lehetséges alkalmazásra a Sry és Aml-X gének egyidejű amplifikálásával. J Reprod Dev 49: 307-311.
13. Prithiviraj F, Melnick J. 2001. Molekuláris ivarú eutheri emlősök. Mol Ecol Notes 1: 350-353.
14. Pilgrim KL, Mckeelvey KS, Riddle AE, Schwartz MK. 2005. Felid nemi azonosítás nem invazív genetikai minták alapján. Mol Ecol Notes 5: 60-61.
15. Pomp D, jó BA, Geiser RD, Corbin CJ, Conley AJ. 1995. Nemek azonosítása emlősökben polimeráz láncreakcióval, és annak felhasználása a 10. vagy 11. sertés embrió átmérőjére gyakorolt nemi hatások vizsgálatára. J Anim Sci 73, 1408-1415.
16. Thibier M, Nimbart M. 1995. A szarvasmarha-embriók nemi terjesztése a terepen. Theriogenology 43: 71-80.
17. Vidya TNC, Roshan V, Aravazhagan C, Sukumar R. 2003. A molekuláris ivarzás alkalmazása szabadon mozgó ázsiai elefánt (Elephas maximus) populációkban Dél-Indiában. Curr Sci India 85: 1074-1077.
18. Villesen P, Fredsted T. 2006. A főemlősök gyors és nem invazív PCR-ivarlás: majmok, régi világmajmok, újvilági majmok és Strepsirrhines. BMC Ökológia 6: 8. [Internet]. Elérhető: http://www.biomedcentral.com/1472-6785/6/8
19. Wasser SK, Houston CS, Koehler GM, Cadd GG, Fain R. 1997. Ursids széklet DNS-terepi vizsgálatának technikái. Mol Ecol 6, 1091-1097.
Állatorvostudományi Kar
Av. Circunvalacián Cdra. 28 s/n - San Borja
03-5137. Doboz - Lima - Peru
Tel .: (511) 435-3348, 236. mellék
Fax: (511) 6197000, 5017 mellék