AZ EMBER PAPILLOMA HPV VÍRUS TÍPUSOSÍTÁSA ÉS KAPCSOLATA A NÉPSÉGI JELLEMZŐKKEL ÉS SÉRÜLÉSEKKEL A Méhnyak rákjaiban NŐKBEN
AZ EMBERI PAPILLOMA HPV VÍRUS TÍPUSOSÍTÁSA ÉS KAPCSOLATA A NÉPI JELLEMZŐKKEL ÉS SÉRÜLÉSEKKEL A NŐKBEN A PASTO SINDY NATHALY NATHALY BENAVIDES BENAVIDES BAVERES BAVÁR BERÁSZÍTÓ BIOLÓGIAI DOKUMENTUM BAJÓZSOROS BAJNOKNAK BÉL SZAKÉRTELEMBŐL. MSc Tudományok Mikrobiológia NARIÑO EGYETEM PONTOS ÉS TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIA TANSZÉK SAN JUAN DE PASTO 2014 2
A diplomamunkában szereplő ötletek és következtetések a szerző kizárólagos felelőssége. A Nariño Egyetem Tisztelt Felsõ Irányelv Tanácsa által kiadott, 1966. október 11-i 1. sz. 324. cikk. 3
Milena Guerrero Flórez igazgató, Dolly Margot Revelo Romo Jurado Edith Mariela Burbano Rosero Jurado San Juan de Pasto, 2014. május. 4
Kollégáimnak Juan Pablo, Vanessa, Diana, Nixon, Carlos, Carolina, Mario, Juan Gustavo, Marcela, Christian társaságukért. Nagyon köszönöm mindannyiuknak. 6.
DEDIKÁCIÓ Önnek, Istenem, amiért erőt, energiát és szeretetet adott nekem a vizsgálat befejezéséhez. Szüleimnek José Nicola és Cecilia Benavides, Ricardo, Diana, David és Mauricio testvéreimnek, akik mindig támogattak és hittek bennem, megadva szeretetüket és megértésüket. Kollégáimnak minden segítségükért, támogató szavukért, tanácsukért és jó energiájukért. 7
TARTALOMJEGYZÉK BEVEZETÉS. 23 1. CÉLOK. 26 1.1 ÁLTALÁNOS CÉL. 26 1.2 KONKRÉT CÉLOK. 26 2. A MŰVÉSZET ÁLLAMA. 27 2.1 EMBERI PAPILLOMA VÍRUS - HPV. 27 2.1.1 HPV típusok és osztályozás. 27 2.1.2 A HPV genomja és szerkezete. 29 2.1.3 A HPV genom régióinak leírása. 30 2.1.4 Az L1 és L2 késői expresszió régiója. 31 2.1.5 Az emberi papilloma vírus változatai. 32 2.2 HPV és méhnyakrák. 33 2.3 A CCU természettörténete. 36 2.4 A HPV kimutatása és molekuláris tipizálása. 38 2.5 Kockázati tényezők a CCU-ban. 41 2.5.1 A szexuális partnerek száma. 41 2.5.2 A nemi kapcsolat megindításának kora. 2.5.3 Orális fogamzásgátlók alkalmazása. 42 2.5.4 Fertőzés más organizmusokkal. 42 2.5.5 Dohányzás. 43 8
2.5.6 Terhességek száma. 43 2,5 7 Hagyományos citológia. 44 3. MÓDSZERTAN. 46 3.1 A vizsgált populáció leírása. 46 3.1.1 Etikai megfontolások. 47 3.1.2. Felvételi kritériumok. 47 3.1.3 Kizárási kritériumok. 47 3.1.4 A vizsgálatban figyelembe vett populációs változók. 47 3.1.5 A minta mérete. 47 3.2 Információk nyilvántartása, minták felvétele, szállítás és megőrzés. 47 3.2.1 Népességi nyilvántartás. 47 3.2.2 Egyváltozós elemzés. 48 3.2.3 Minták felvétele. 48 3.3 Minták feldolgozása a HPV molekuláris tipizálásához. 48 3.4 A minták minőségelemzése β-globin PCR-rel. 49 Minták előkészítése a minőségelemzéshez. 49 3.4.1 A minta minőségének értékelése PCR/HHB amplifikációval. 49 3.4.2 A PCR/HHB termékek ellenőrzése agarózgél-elektroforézissel. 51 3.4.3 A PCR/HHB eredmények értelmezése. 51 3.5 HPV kimutatása és molekuláris tipizálása. 51 3.5.1 Gépelés fordított vonallal. 52 3.5.2 PCR-L1 GP5 +/GP6 + és DNS szekvenálás. 56 9
4.3.1 Citológiai (-), ASCUS és HPV fertőzésben szenvedő nők populációs jellemzői. 87 4.3.1.1 Szociodemográfiai jellemzők és HPV-fertőzés. 87 4.3.1.1.1 Kor és HPV fertőzés. 88 4.3.1.1.2. A szexuális partnerek száma és a HPV-fertőzés. 89 4.3.1.2 Gyneco-szülészeti jellemzők és HPV-fertőzés. 91 4.3.1.2.1 Tervezési módszer és HPV-fertőzés. 92 4.3.1.2.2 Egyéb organizmusok és HPV-fertőzés. 93 4.3.1.3 Gyulladással és HPV fertőzéssel járó reaktív sejtváltozások. 93 4.3.2 LIEBG, LIEAG, CCU elváltozásokban és HPV fertőzésben szenvedő nők elemzése. 94 4.3.2.1. LIEBG, LIEAG, CCU és HPV fertőzésben szenvedő nők életkora. 94 4.3.2.2 LIEBG, LIEAG, CCU elváltozások és HPV fertőzés. 96 4.3.2.3 LIEBG, LIEAG, CCU elváltozások és HPV típusok. 100 KÖVETKEZTETÉSEK. 102 AJÁNLÁSOK. 104 BIBLIOGRÁFIA. 105 MELLÉKLETEK. 127 11
23. táblázat: A HPV-fertőzés gyakorisága a LIEBG, LIEAG és CCU nők életkorának megfelelően. 95 24. táblázat: A HPV fertőzés gyakorisága LIEBG, LIEAG és CCU nőknél. 97 25. táblázat: A LIEBG, LIEAG és CCU nőknél talált HPV típusok gyakorisága. 100 13
Az ábrák felsorolása 1. ábra: Az LCR HPV 16 szekvenciák filogenetikai fája 28 2. ábra: A humán papilloma vírus genomja. 29 3. ábra A nyaki HPV onkogenezisének természettörténete. 36 4. ábra A méhnyakrák szövettani fejlődése. 38 5. ábra: Squamous cell atypia (ASC-US). 45 6. ábra Pasto község térképe, ahol a minták felvételi helyei találhatók. 46 7. ábra: PCO3 és PCO4 primerek gyűrűzése az emberi β-globin génben, 13 nta pozíció 123 ntg-nél. 8. ábra: A GP5 + és GP6 + láncindítók gyűrűző helyének ábrázolása a HPV 18 genomban, 6600 nta - 6744 ntg. 52 9. ábra A β-globin gén amplifikációja a nyaki fogmosás mintáiban. 73 10. ábra A β-globin gén amplifikációja biopsziás mintákban. 74 11. ábra. Mg ++ optimalizálási vizsgálat. 77 12. ábra: A HPV L1 gén amplifikációja. 77 13. ábra: Az UDN 217 mintában azonosított szekvencia összehangolása Blastn és MegaBlast által az NCBI-től. 80 14
MELLÉKLETEK FELSOROLÁSA A. melléklet. Tájékoztatott beleegyező űrlap. 127 B. melléklet. A rák megelőzésének klinikai kórtörténete. 132 C. melléklet. Citológiai eredményformátum. 133 D. melléklet. Mg ++ optimalizálási teszt PCR/L1 GP5 +/GP6 + esetén. 133 E. melléklet. Negatív fordított vonal-blot eredmények. 135 F. melléklet. A nyaki fogmosás és a biopsziás minták szekvenciájának összehangolása. 136 15
prb: Retinoblastoma Protein RCS: angol rövidítésből [The Rapid Capture System] mRNS: Messenger Ribonukleinsav RLB: angol rövidítésből [Reverse Line Blot] HSV: Herpes Simplex vírus HSV-2: Herpes Simplex vírus 2-es típusú HIV: Humán immunhiányos vírus HPV: Humán papillóma vírus HPV-RA: Humán papillóma vírus magas kockázatú HPV-BR: Humán papillóma vírus alacsony kockázatú 17
CIN II: Magas fokú laphám intraepithelialis elváltozásnak számít. A nyaki hám bazális kétharmadára korlátozódik. CIN III: Az ilyen típusú, szintén magas fokúnak tekintett sérüléseknél a dysplasia súlyos, és a nyaki hám több mint kétharmadát lefedi. Bizonyos esetekben a nyaki bélés teljes vastagságát is beleértve. PCR-L1: Polimeráz láncreakció, amely lehetővé teszi a HPV L1 gén körülbelül 150 bp-os fragmensének amplifikálását GP5 +/GP6 + primerek alkalmazásával. MEGELŐZÉS: Ez egy betegség vagy esemény előfordulásának száma a populációban és egy adott időpontban. REVERSE LINE BLOT: Ez egy fordított hibridizáción alapuló vizsgálat, amely lehetővé teszi 37 HPV genotípus azonosítását miniblotter rendszer és hibridizációs membrán segítségével, miután a mintákat GP5 +/GP6 + PCR-rel amplifikálták. HPV-RA: Magas onkogén kockázatú humán papillomavírus, amely invazív ano-genitális karcinómák kialakulásához kapcsolódik. BR-HPV: Alacsony onkogén kockázattal járó humán papillomavírus, jóindulatú elváltozások-szemölcsök és condylomák kapcsán. húsz
lehetővé téve a HPV-fertőzés és a CCU későbbi kialakulásának veszélyeztetett populációjának jellemzését. A CCU minden érintett populáció magas viselkedési komponensét vonja maga után, ezért fontos elemezni néhány dokumentált kockázati tényezőt más populációk esetében, és meg kell erősíteni azok hatását egy adott vizsgálati populációra. Ezeknek a változóknak és hatásuknak az elemzése rendkívül fontos az ok-okozati összefüggések hálózatának és a rosszindulatú daganatba való potenciális progresszió megértéséhez. Ebben a kontextusban ebben a kutatásban az RLB adaptációján alapuló molekuláris módszertant értékelték, amely PCRL1 + szekvenálásból állt, annak érdekében, hogy információkat nyerjünk a HPV-fertőzésről, a CCU-elváltozásokhoz kapcsolódó genotípusokról és néhány kockázati tényező kapcsolatáról, mint pl. orális fogamzásgátlók alkalmazása, a szexuális partnerek száma, életkora és más mikroorganizmusokkal való együttes fertőzés annak érdekében, hogy megértsék dinamikájukat a vizsgált populációban. 25
1. CÉLKITŰZÉSEK 1.1. ÁLTALÁNOS CÉLKITŰZÉS A HPV típusa, a szociodemográfiai, nőgyógyászati-szülészeti, klinikai jellemzők és a méhnyakrák elváltozásai közötti kapcsolat elemzése Pasto község női populációjában. 1.2. KÜLÖNLEGES CÉLOK A HPV kimutatásának és molekuláris tipizálásának elvégzése Pasto községben élő nőknél. A vírustípus és egyes szociodemográfiai, szülészeti-szülészeti és klinikai jellemzők közötti kapcsolat meghatározása a HPV-fertőzés és a méhnyakrákos elváltozások között. 26.
5. ábra: Squamous cell atypia (ASC-US). Sejt, amelynek magja a normál méretének két és félszeresére nőtt, de a sejtmag membránjának megerősödése nélkül. Forrás: Alonso et al., 2005. 45
3. MÓDSZERTAN 3.1 A vizsgálati populáció leírása Ezt a vizsgálatot kétéves időtartam alatt végezték el, amelyben citológiai rendellenességek nélküli nők, akik beleegyeztek, hogy tájékozott beleegyezés aláírásával részt vegyenek a vizsgálatban, és akik megfelelnek a felvétel kritériumainak, a Az állam szociális vállalkozása Pasto Salud-ESE. E minták felvételére a Pasto Salud ESE-hez tartozó 23 IPS közül 8 IPS-t véletlenszerűen választottak ki négy területen: Pasto község északi, déli, keleti és nyugati részén. A laboratóriumi elemzéshez használt minta a nyaki fogmosás maradványából állt (friss minta). A citológiai rendellenességben szenvedő nők populációjának kiválasztását az összes patológiai jelentés teljes körű áttekintésével végezték el, 24 hónapos időszakban, 2013 decemberéig. A felvételi kritériumoknak megfelelő nők 32 biopsziáját vették fel, de Pasto-tól és diagnosztizáltak bizonyos fokú rendellenességek LIEBG és LIEAG a CCU számára a társult patológusok LTDA-ban. 6. ábra Pasto község térképe, ahol a minták felvételi helyei találhatók. Forrás: Google Earth. 46
4.2 A HPV kimutatásának és molekuláris tipizálásának eredményei 4.2.1 A minták minőségének elemzése a β-globin gén fragmensének amplifikálásával a teljes vizsgálati populációra. A 160 méhnyakkefe mintából 152 pozitív volt a β-globin génre, és alkalmasnak tartották az RLB és a PCR-L1 GP5 +/GP6 + szekvenálással történő tipizálásra, ennek a szűrésnek az eredményeit a 9. ábra mutatja. 9. ábra. Amplifikáció a β-globin gén nyaki fogmosási mintáiban. 1. vonal: GeneRuler Ultra Low Range DNS létra molekulatömeg-jelölő (10-300 bp), 2. vonal: üres (ultra tiszta víz), 3-25-ös sor: PCR/HHB amplifikál az UDN183-UDN205 nyaki kefe-mintákból. Forrás: Ez a kutatás. A 32 biopszia minőségi elemzésében a β-globin gént az összes mintában sejtlizátumból amplifikálták, és ezeket tipizálásnak tekintették. A szűrés eredményeit a 10. ábra mutatja. 73
11. ábra. Mg ++ optimalizálási vizsgálat. 1. vonal: GeneRuler Ultra Low Range DNS létra molekulatömeg marker (50-1000 bp), vonalak: 2-6: Amplifikálva a HPV 33-ból különböző mennyiségű és koncentrációjú Mg ++ 7. vonalon: Üres (ultra tiszta víz). Forrás: Ez a kutatás. Következésképpen az MgCl2 koncentráció optimalizálása és a PCR-L1 GP5 +/GP6 + reakcióelegyben történő beállítása lehetővé tette a sejtlizátumból származó HPV fertőzés kimutatását a citológiai (-) nők 1,4% -ában (2/143), a 11.1-ben (1/9) az ASCUS-ban szenvedő nőkből és 34,4% -ban (11/32) a LIEBG, LIEAG és CCU nőkből, összesen 14 HPV + minta. A megfelelő eredményeket a 12. ábra mutatja be. 12. ábra: A HPV L1 gén amplifikációja. 1. sor: HyperLadderTM 100 bp biolin molekulatömeg-marker (100 bp-1013 bp), 2. sor: üres (rendkívül tiszta víz), 3-16-os vonalak PCR/L1 termékek, 3., 9. és 12. sor HPV + minták (UDN217: HPV 16, UDN 331: HPV nincs meghatározva és UDN 338: HPV 58), 15. és 16. sor: A HPV 11 és a HPV 33. amplifikált pozitív kontrolljai. Forrás: Ez a vizsgálat. 77
4.3 A HPV-fertőzés, a populációs jellemzők és az elváltozások közötti összefüggés elemzése a CCU-ban 4.3.1 Citológiai (-), ASCUS- és HPV-fertőzésben szenvedő nők populációs jellemzői 4.3.1.1 Szociodemográfiai jellemzők és HPV-fertőzés. Ennek a populációnak a Chi-négyzet teszt segítségével végzett elemzése, amelyet a HPV-fertőzés és a szociodemográfiai, nőgyógyászati-szülészeti és klinikai jellemzők között végeztek, azt mutatta, hogy nincs statisztikailag szignifikáns összefüggés, szignifikanciaszint pe 4 7> 1 p-érték 0,577 0,325 0,900 K * a, b, c, d, e: a korosztályok kódjai. * C (-): Negatív citológia. # M: Minták száma; HPV +: Pozitív minták a HPV fertőzéshez. Forrás: Ez a kutatás. 87
A HPV molekuláris detektálásában a Kappa index egyeztetést mutatott a citológia és a PCR-L1/szekvenálás között, utóbbi lehetővé tette a HPV-RA 16, 58 és 33 detektálását és tipizálását, míg a citológia csak a rendellenességek detektálását tette lehetővé a HPV azonosítása nélkül típus. 103.
AJÁNLÁSOK A kutatásban alkalmazott módszertan érvényesítése felé kell haladni annak érdekében, hogy ismerjük a valódi alkalmazhatóságot, érzékenységet, robusztusságot, reprodukálhatóságot és költséghatékonyságot más kereskedelemben kapható HPV-tipizálási módszerekkel szemben. Célszerű nyomon követni azokat a nőket, akik citológiával (-), ASCUS (+) és HPV (+) vannak, annak érdekében, hogy az egészségügyi szolgáltatókat időben beavatkozásra ösztönözzék, és ezáltal minimalizálják az új CCU esetek megjelenését. A jövőbeli kutatások során ajánlatos olyan módszereket felvenni, amelyek értékelik az olyan gének jelenlétét, mint az E6 és E7, mivel ezek lehetővé tennék a HPV-fertőzés kimutatását a CCU-val rendelkező mintákban, valamint a vírusterhelés értékelését, a nemi érintkezés megindítását és más tényezőket is beszámoltak a tanulmányban. a CCU keletkezése. 104
A várt eredmények között: a populációra vonatkozó információk molekuláris információkkal együtt elemezhetők a HPV-fertőzés és annak összefüggéseinek a CCU kialakulásával való magyarázására, a Pasto községben a HPV-fertőzés és a későbbi CCU-kialakulás veszélyeztetett populációjának jellemzésére, a molekuláris módszertan a HPV kimutatására, és ajánlások kidolgozása a Pasto CCU kialakulásának kockázatával küzdő betegek kezeléséért felelős felügyeletért és ellenőrzésért felelős szervezetek számára. * Ha úgy dönt, hogy részt vesz a vizsgálatban, méhnyakkefe mintát veszünk. A mintavételhez megfelelően képzett személyzet lesz, valamint steril anyagokat kell használni az ilyen típusú eljárásokhoz megállapított biológiai biztonsági feltételek mellett, oly módon, hogy minimális legyen az egészségre gyakorolt hatás kockázata. 128
BEVEZETŐ VISSZAVONÓ LEVEL Készítette: Claudia Sánchez, Karen Suárez, Nathaly Nicola és Milena Guerrero F. POE: 1. oldal Page 4 Fő kutató: A vizsgálat helyszíne: A résztvevő neve: Ezen a csatornán keresztül tájékoztatni kívánom határozat a vizsgálat visszavonásáról a következő okok miatt: (választható) A résztvevő aláírása Dátum Cím Tanú Dátum Cím Tanú Dátum Cím 131
B. melléklet. A rák megelőzésének klinikai kórtörténete
C. melléklet. Citológiai eredmények formátuma 133
D. melléklet. Mg ++ optimalizálási teszt PCR/L1 GP5 +/GP6 + reagenshez A reakciókomponensek mennyisége (µl) E 1 E 2 E 3 E 4 E 5 Ultratiszta víz 8,75 8,75 8,75 8,75 8,75 8, 75 Puffer (1X) 5 5 5 5 5 dntps (200 µm) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 GP5 + (1µM) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 GP6 + (1µM) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 HPV 33 DNS 1 1 1 1 1 Taq pol (1,25 U) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 MgCl2 (C) (1 mM) (1,5 mm) (2,0 mm) (2,5 mm) (3,0 mm) További ultratiszta víz 3,5 µl 3 µl 2,5 µl 2 µl 1,5 µl E = MgCl2 optimalizálási teszt. (C) = 134-es koncentráció
E. melléklet. Negatív fordított vonal-blot eredmények. 2. oszlop HPV 33 kontroll, 3-40. Oszlop, nyaki fogmosás minták, 41. oszlop HPV 33 kontroll