A BUENOS EGYETEM AIRES A PONTOS ÉS TERMÉSZETES TUDOMÁNYOK KARA 110 n a vírus oogglementqimmigganancia vagy immunocmmatogggia g fixálásának egyikének vizsgálata Mario Mama re]. Zakin szakdolgozat összefoglalása 1963. év
UNIVERSIDAD DE-BUBNOS AIRES PONTOS ÉS TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR Applicggión dg gg t6c3 gaa de tljggión do cggnlcnonto 1nnnnorluo ggggggcig és immunochronatosgggy a vírus tanulmányozásához do la waste grcigg 196
A szakdolgozat támogatója: Dr. Osvaldo A.Peso
célja ÉES Y METONS te le 1) mguoreecemil e) Antigenoedricee A fertőzött állatok természetű szervei]. és kísérletileg a sertéspestis. A A le prinre-ben használt oktatóanyagok. A tapasztalatok egy része a kísérletileg megfertőzött enimelee és a pestis békemozi. ha az eoepechoea lábához tartozó enilalea szerint ezek az utolsó szervek különböző dd országból származnak. pont A második tanítási sorozat esetében a 25 és 30 kg súlyú sertéseket 2 1. iqyeotedos eubeutáneemente-vel fertőztük meg. a sertésláz-vírus LM13 17-es szuszpenziójának felhasználása: letöltési anyagként a Laboratoriosmi-nál. A fertőzést követő harmadik és nyolcadik nap között Enimlee-t feláldoztuk, és csókot gyűjtöttünk. ganglion és vese. b) szérumok és globalinaa A - Sertéspestis hyperinnme szérum. virulens defibrinnel történő oltással nyerhető olyan sertéseknél, amelyek már rendelkeznek valamilyen immunitással. aea oltással, .látni betegségenként. A szérumot a Fuerte Sancti Spiritu Laboratories-hoz juttattuk. // 9
B - Suoro do antiporoino nyúl, amelyet egymás utáni oltással nyernek. nachóval vagy vállral, normál sertésszérum adagokkal. A napi dózisok 0,1 és 0,2 1 között változtak, az oltások száma 16 volt, másfél éven át beadva. Az első oltás során Freund olajbogyóit alkalmazták, az adjuváns szerint 2: 1 arányban. A proepitin toxicitás módosításával kapott titerek 1/12800 és az egész érték között voltak. minden állat a következő volt: Inoo. nl m1 N 'nat. Freund vi t1 m90 do oltás 1. 1. 2 ac x) 2 0 1 '1P (x) 1 Banán 3 0. 1 o 1n (m) 2 és 4 O. 1 - o 2 nn 5 0,1-1p 3 nn 6 Q. 1 - m 2 nn 7 0,1 oo 2 a 8 0,15-1p 3 a 9 0. 15-13 2 nn 10 Oo15 - o 2 a 11 0,15 vagy 1p 3 nn 12 0,15-1! 2 n n 13 0,15 o o 2 n n 14 Oo2-1p 3 n n 15 0,2 c 1m 2 n n 16 0. 2 o e 2 u n (x) ao - euboutánnu (zz) 1p a intraporitonális (xxx) 1. - intranusoulor llo
szobahőmérsékleten, majd megfertőzzük a csapadék két rétegét. 11.- tisztítás a DEAEcellulóz oszlopon való áthaladással. a technikai ds Courtsin szerint (28). A DEAEcellulózt, miután megmostuk és pH-ját 6-ra állítottuk, 0,02 M pufferben (pH 6) (foszfátpuffer) szuszpendáltuk. míg a konjugált anyag. megtisztítani. egy éjszakán át dializáltuk ugyanazon kipufogódob ellen. Az érdeklődés tisztított frakciója. Ezt 0,02 MpH 6 pufferrel hígítottuk, míg a szennyeződéseket az oszlopból pH 5,2 pufferrel távolítottuk el, amelyet már korábban leírtunk. A folyadékot Carbowax 20 M-vel végzett dialízissel az eredeti térfogatra koncentráltuk. I. Normál sertésszérum. sertéspestis-mentes állományokból származó leohonokból nyerték. és be nem oltottak. o) Oldatok és reagensek A- CIN .oososaoso-szóda-koz-foszfát fiziológiai oldat. 801 8 P0HI. 0 0,00,0. - 2048 4 2 2 Desztillált víz, pl. PH 7-8 "811 B - 1000 ml oooooooooooooooooo ÜO3HNh puffer szénhidrogén-dioxid-dioxidhoz 0,000.000.00000000 Agus desztillált kupak. 400 m1 PH 9 G // 17
c - Puffer a konjugált cocoootneoe fehérje dialíziséhez 100.00.00.00003232 g eeeoeeeeeoeeeeeo 7,2 g Aguad'atilad. kapucni. o.u40 0,1 PH 7 D- Veronális puffer veronátrium-elektroforézishez. 7,33 g nátrium-acetát. 01H0,1N. 4,86 g 45ll desztillált víz oszp. 750m1 ph 8,6 E o A módosított Koch és Malbekin (1924) metodoeolorln trioo-ban használt reagensek: - Emésztési oldat: Az 5% -os réz-szulfát oldatot 100 ml tömény és tiszta kénsavval elegyítettük. A kapott oldatot óvatosan 100 ml desztillált vízbe öntjük. Ammónium-szulfát kontrolloldata: 9,4332 g tiszta monikaszulfátot és seoo-t oldunk 3043-ban! 0,2 N az 1000 m1 teljesítéséhez. A 80 32 0,2 N oldatot úgy kaptuk, hogy 5,6 1 tömény savat feloldottunk vízben, amíg 1000 ml-t nem kaptunk. Ez a tömény oldat 2 µl R/nl-t tartalmazott, és hígításra volt szükség ahhoz, hogy kontrollként használjuk. Víz 20 nl (40 mg N) tömény ammónium-szulfát-oldatban. Hozzáadunk 180 nl SO4H20,2N-t, és desztillált vízzel 1 literre töltjük. Ennek az oldatnak minden ml-je 0,04 Ig I. // 18 értéknek felel meg
- Neeeler-reagens: 22,5 g jódot feloldunk 20 nl 30-5 IK-ot tartalmazó anában. Miután az oldódás befejeződött, 30 g Hgmetallic-ot adtunk hozzá, és ez jól sikerült, elkerülve a forró keverést, és szamáráramban lehűtve. A keverést addig folytattuk, amíg maga a jód színe el nem tűnt. A felülúszó folyadékot dekantáltuk, és a reakciót keményítőoldattal szemben teszteltük. Amikor a reakció negatív. a reagensben higany jött ki. ezért hozzáadott néhány cseppet ugyanolyan korábbi koncentrációjú jódot. Jódot adunk addig, amíg enyhén pozitív reakciót nem kapunk a keményítővel szemben. Az oldatot vízzel hígítottuk, hogy 200 ml OHNeal lofil Buffere térfogatát kitöltsük, majd oszlopkromatográfiásan kettővel vagy 0,2 MpH 6,3 foszfátpufferrel kevertük: 387 ml 0,2MPOHN 4 2 (A) -ot megolvasztottunk 112,5 ml 0,2-204 HN32 oldattal. (B); Ily módon 0,2 M foszfát-pufferrel rendelkezünk, amelynek pH-ja 6,3. Enni. Az oldathoz 100 µl-t vettünk, és 1040 ml desztillált vizet adtunk hozzá. a foszfátpuffer 0,0175 MpH 6,3. - 0,02 MpH 6 foszfátpuffer: ha 877 nl (A) -ot kapunk, akkor összekeverjük 123 ml (B) -vel, így 0,2 H ph 6-os foszfátpuffert kapunk. 100 1 és 1000 liter hígítását desztillált vízzel kapjuk meg a puffert 0t02 l ph 6. // 19
- Puffer ph 5,2 0,00,0000000090000000 g CINE0,0,00,0,0,0,0,00000000000000 Víz PH 5,2 GBP 00 000 000. Minden anyag, a megoldások kivételével. -20 ° C-on fagyasztva tartották a felhasználás pillanatáig. Az oldatok 4 ° C-on voltak. G 2) Az eomglement fljgclón a) Vírusantigének: Ugyanazok, amelyeket az immunfluoroszoenciában használtak. Az összes antigén anyagot a következő eljárásnak vetettük alá: I - őrlés és szuszpenzió 1/5 arányban 11 vcronális pufferben - fagyasztás -20 ° C-on 24 órán át. Minimálisan. 111- Deoongoláció. Centrifugáljon 3500 fordulat/perc sebességgel 15 percig. IV-kezelés 20% kloroformmal. egy percig rázva, majd 10 percig centrifugálva 3500 fordulat/perc sebességgel a kloroform eltávolítása céljából. V vagy ugyanazon előző lépés megismétlése, ha az anyag átlátszatlansága szükségessé teszi. VI- Centrifugálás 15 000 rpn mellett. 15 perc. A klorofóm zaj 711 -minosítása vákuumszivattyúval. b) A szérum vagy Serum hyporinuno do sertéspestis B - Szérum névleges sertés * // 2.
G- Egyéb anyagok: a kobuo-komplement, a hemolitikus rendszer és a veronális puffer ph 7. 6. azonosak voltak az INTA Száj- és Száj- és Szájbetegség Intézet 1. Szerológiai Szekciójának rutinmunkájában (29, 30, 31). A komplementet 400 g nőstény mézes oobayoe vagy nem vemhes nőstény behúzásával kaptuk. Az említett kiegészítés címe!) 50 technikájával! a hemolieis-ból Oeler et al. (16) Adidodietil-karbiturikus veronális puffer. 9200 másodperc 1 liter desztillált vízben oldva. oeeooeeoeeoeeeeooo 2 6 eeoeoeeooee-eno.eoeee-eeoeee Dieülbarbiturate d. 00610 eeeeooo 6 g 01113. 167,600g 603m. 5,04 g-ot 4 liter desztillált Galegas-szal kiegészítünk és leszűrünk. Az etl-t megsemmisítettük. 20 perc alatt. g 3) Immungoorogtoggg ph 7,66 (1/5-ös használatra) e) Antigenoe viriooe: Ugyanaz, amelyet a két korábban említett reeooionban használtak. Az antigének előállítása hasonló volt a komplement rögzítéséhez szükséges antigénekéivel, kivéve a // 21-et
az I. lépésben, amelyben a szuszpenziókat nem ph7.8 - O. foszfát-fiziológiás oldattal vagy veronális puffer helyett, ph 7. 6. b) Szérumok: Sertéspestis Hyperimne széruma B - Sunro normál sertés 012199 anyaggal: Foszfát fiziológiai oldat. ph7.8 vagy 8. amelynek képlete a fent felsorolt. Módszerek 1) Imnofluorcencigig technika Atom Prggoion; Csúszni akarok. Hatásos élettani oldattal 59 benyomást tett az antalbrmontelavubs szervre. A keneteket 20 percig rögzítettük; -20 ° C-os acetonban. Bidostilált vízzel mostuk, kivettük és 4 ° C-on nem tároltuk. Az alkalmazott módszer közvetett volt. Először a már nem rögzített hyporinon szérum cseppeket helyeztük el a keneten, már rögzítve. 10 percig 30 MmtogaJBQWngdn-t hagytunk egy hideg kamrában, hagytuk száradni és ab "kezeltük, ismét nedves kamrában, a jelzett anyaggal. Ebben a lépésben az inkubálás 50 percig 37 ° C-on volt. csúsztassuk bideatilezett agával, hagyjuk megszáradni és a mai-6,6-ot a megfigyelési mikroszekvenciáig 40 ° C hőmérsékleten.
Vezérlők Ellenőrzéseket vagy normál szérumokat készítettünk. Ortholux típusú Leltz fltzlor mikroszkópot használtunk, amelynek fényforrása a; lámpa 1/4 3 t Ï. 4 a - + 17; - C. 1 4 '18 + 1/52 4 + naad no - - gai 111 9 C dm - x 21.22 a. -. Í -. + 23 * + 1 a '24 25 «I-1/32 + t * - I- - '+ 26 + 1/5 '- E 27 +> 1/40 4 á + 28 + 1/30 É td + 29 + 1/33 -; 3o' F 1/24 + ag 31 + 1/30 i + e + + 32 1/40 + E - r + 33037039 34.35.40 -0 - '+ .- = + -. + L.5 5' + -, _ + 4 + 38 1/18 1/38 "1/5 1/40-3 í - - '. + - + 41 + 1/60: í + a Általános Alvnr + 1/25 I + g + Fc a Komplement-fixáció IF s Imnofluoruccnce IC s Immochronatomfh I sertés z Inokuláció sertésekben DDIH'I + 00. - pozitív natív mamut. pozitív kétes anticonrplemenuna Amikor még egy sorba teszem az anyagomat. azt jelenti
a sertéseknél az oltás komplement rögzítés volt (50% -os hembysis). Mindkét tonik egybeesése 74,3% volt. Az inlnnofluoreseenoia technikát illetően. Nyilvánvalóvá válik, hogy érzékenysége még mindig lényegesen alacsonyabb, mint a komplement rögzítése, és összehasonlítja az értékeket az oltási módszer és az immunfluoreszenoén módszer között. az egybeesés 43% volt, figyelembe véve a kétes kategóriában E-nek feltüntetett adatokat, és nem pozitív vagy negatív. Az innunoeronatograria technikával kapcsolatban látható, hogy pillanatnyilag kevésbé érzékeny. A négy módszerrel kapott eredmények összehasonlítása. és az egyező százalékokat. a III., a IV. és az V. táblázatokban találhatók. A négy teonio között, amelyek aktívak az FC Coinó sertésekben, a pozitív teo-pozitívak között pozitív pozitív CU DE II szerepel. az IF Caine-nél az IC Coinóban. 35], 26 74,3 15 43 11 31,5 GUÉDHD IV Összehasonlító táblázat sertések ninokulációja és a komplement rögzítése között Pozitív fülek Pozitív komplement rögzítés 5 (50%) 35 26 li '74 .3 4 // 38
20 érzékszervi teszt nagy fertőzésű anyagok felhasználásával olyan állatokból, akiket nagy dózisban virulens malária fertőzött meg. Az antigén kimutatása fertőzött kísérleti állatokban 1, amelyeket a fertőzés után különböző időpontokban áldoztak fel, amint azt a főzési anyagok kifejtik, az immunfluoreszcenciában használt antigén B. bekezdésében. A sertéspestis-mentes és be nem oltott állatokat vírussal oltották be, és a harmadiknak áldozták fel őket. negyedik ötödik. hatodik. hetedik és nyolcadik nap az oltás után. A lépet betakarítottuk. az említett állatok mesentericus ganglionjai és veséje, és kísérletet tettek az antigén jelenlétének komplement rögzítéssel és immunfluoreszcenciával történő kimutatására. A tapasztalt állatok adatai. Ani, mint az általuk elszenvedett klinikai rendellenességek, a VI. Táblázatban találhatók. Klinikai kép Az állatok VI. TÁBLÁZATA a levágáskor Állat Klinikai rendellenességek N levágás ideje fertőzés után 181 nincs 3 nap 132 nincs 4 nap 183 nincs 5 nap 184 hőmérséklet. 41,5 0 6 nap 185 13011 113-410500 7 mondd meg neki 166 temp. 42 C, általános bomlás 8 vacsora 187 nincs 3 nap 188 nincs 4 nap 189 nincs 5 nap 190 temp. 41 C 6 nap 191 hőmérséklet 42 C 7 nap 192 i hőmérséklet. 42,5 C, általános deoaimion 8 nap