pylori

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények és vita
  • A bél mikrobiota és H. pylori befolyásolta a leptin és a ghrelin szintjét
  • Indukált normális inzulintermelés mert bél mikrobiota és H. pylori
  • Által kiváltott PYY H. pylori de elnyomta a normális bélmikrobiota
  • Bél anyagcsere hormonok és testtömeg
  • A bél mikrobiotájának és H. pylori a korai fejlődésben
  • Mód
  • Törzse H. pylori és az oltóanyag előkészítése
  • Állatok és oltás
  • Etikai nyilatkozatok
  • Plazmaminták gyűjtése
  • Bélhormonok és citokinek multiplex vizsgálata
  • statisztikai elemzés
  • Hozzászólások

Tárgyak

  • Klinikai mikrobiológia
  • Kísérleti betegségmodellek.

Összegzés

Bevezetés

Az ősi gyomor kórokozó, a Helicobacter pylori, az emberi gyomor mikrobiomjának kulcsfontosságú tagja. Az emberi fajjal együtt alakult ki, és a H. pylorival való kapcsolatunk 60 000 évre nyúlik vissza 9. Ezenkívül a világ népességének több mint felénél fekszik, függetlenül etnikai származásuktól és földrajzi régiótól 10. Sokan már a korai gyermekkorban megszerezték a baktériumokat családon belüli átvitel útján, és a kolonizáció egész életen át tartó, kivéve, ha orvosi beavatkozás révén kiirtották őket. Noha a legtöbb hordozó tünetmentesen marad, körülbelül 20% -uk végül az élet utolsó szakaszában gasztroduodenális betegségeket (például krónikus gastritis, peptikus fekély és gyomor adenocarcinoma) fejleszt ki. Számos tényező, köztük a H. pylori, a bél mikrobiota, a gazda és a környezet hozzájárulhat a H. pylori-hoz társuló betegségek kialakulásához. .

Ebben a tanulmányban az volt a célunk, hogy megvizsgáljuk a H. pylori és a normál bélmikrobiota közötti kölcsönhatást az élet korai szakaszában GF és SPF egér modellek felhasználásával. Annak érdekében, hogy megértsük a H. pylori és a normál bél mikrobiota hatásait az anyagcsere és az immunrendszer fejlődésére, értékeltük a bél metabolikus hormonjainak és a citokinek/kemokinek változását az egerek H. pylori kolonizációjára adott válaszként. GFH és SPFH.

Eredmények és vita

A H. pylori-t az SPFH-ból és a GFH-beoltott egerekből nyertük ki a kolonizáció után 2, 8 és 16 héttel. Ez azt mutatta, hogy a H. pylori 298 törzs sikeresen megtelepítette az ezzel a szervezettel beoltott egerek gyomrát. Másrészt az SPF és a GF egerek egyike sem volt pozitív a H. pylori szempontjából .

A H. pylori hatása a normál bélmikrobiom összetételére és működésére még nem tisztázott teljesen. Ebben a tanulmányban azonban előzetes eredményeink azt mutatták, hogy a H. pylori megváltoztathatja gazdája energiaháztartását, és hogy a normál bélmikrobiom megváltoztathatja a H. pylori gazdára gyakorolt ​​hatását.

Bél anyagcsere hormonok és testtömeg

Egy metaanalízis, amely beszámolt a H. pylori és az elhízás prevalenciájáról több mint 100 emberi alany véletlenszerű populációs mintájában, és megállapította, hogy fordított összefüggés van a baktériumok prevalenciája és a túlsúly/elhízás aránya között a fejlett országokban 29. Korábban kimutatták, hogy az élelmiszerrel összefüggő keringő leptin és ghrelin szintje megváltozik a H. pylori felszámolása után humán önkéntesekben a testtömeg-index (BMI) növekedésével társulva, amely bizonyítja, hogy a H colonization pylori szabályozni tudja a ghrelin és a leptin szintjét befolyásolja a test morfometriáját 30. Ebben a tanulmányban kimutatták, hogy a H. pylori kolonizációja fiatal GF egerekben csökkent testtömeg-növekedést eredményez.

Az SPFH egereknél szignifikánsan magasabb volt az éhomi leptin, inzulin és PYY, mint az SPF egereknél. A hormonszintbeli különbségek ellenére az SPFH egerek testtömege normális volt. Feltételezzük, hogy a PYY H. pylori-asszociált upregulációja arra ösztönözte a gazdaszervezetet, hogy válaszul több inzulint és leptint termeljen, ezáltal fenntartva a normális testtömeget. A megnövekedett PYY-éhgyomor, inzulin és leptin hosszú távú következményeit azonban még nem határozták meg. Másrészt a GF és a GFH egerekben nagyobb volt a ghrelin, alacsonyabb a leptin és az inzulin mennyisége, mint az SPF és SPFH egerekben. Továbbá a 16 hetes GFH egerek PYY szintje magasabb volt, mint a GF egereknél. Mindezek a hormonális különbségek a GF és a GFH egerek között az SPF és az SPFH egerek között összefüggésbe hozhatók testtömegükkel. Érdekes módon a H. pylori testtömegre gyakorolt ​​hatása a GFH egerekben nyilvánvalóbb volt, normál bélmikrobiota hiányában.

Meghatároztuk a testtömeg és a különböző bél metabolikus hormonok/eotaxin-1 közötti kapcsolatot (1. táblázat). Kimutatták, hogy a leptin és a PYY szintje szignifikánsan összefügg (30. oldal. Ezért a H. pylori-t szabályozó metabolikus hormonok szerepet játszhatnak az elhízás távol tartásában.

A Gut Microbiota és a H. pylori lehetséges hatásai a korai fejlődésre

Heijtz és mtsai. számoltak be arról, hogy a tanulmányban használt ugyanazok a GF egerek nagyobb motoros aktivitást és kevesebb szorongást mutattak az SPF 8 egerekhez képest. Ez korrelált a motoros kontrollt és a szorongásszerű viselkedést szabályozó gének megváltozott expressziójával. Ugyanez a jelentés azt is kimutatta, hogy az élet elején a normális bélmikrobiotának kitett GF egerek hasonló tulajdonságokkal bírnak, mint az SPF egerek. Ez a megfigyelés összefüggésbe hozható a táplálék felszívódásának megváltozásával GF egerekben normál bélmikrobiota hiányában, ami alultápláltsághoz és fogyáshoz vezet. Köztudott, hogy a táplálkozási szint közvetlen hatással van a fejlődés korai szakaszára (ideértve az agy és a mentor fejlődését is). Ezenkívül kimutatták, hogy a ghrelin knockout egerek kísérleti körülmények között fokozzák a szorongást különféle stresszorok, például akut restrikciós stressz és szociális stressz hatására 31. A ghrelin magasabb szintje a GF egerekben megmagyarázhatja a Heijtz és mtsai által közölt megváltozott viselkedést a GF egerekben is. .

Az eotaxin-1 megemelkedett szintje a vérplazmában egerek és emberek öregedésével is összefüggésben van 32. Kimutatták, hogy a fiatal egereknek az idősebb egerekből származó eotaxin-1 vagy vérplazma expozíciója csökkenti neurogenezisüket és kognitív teljesítményüket olyan viselkedési feladatokban, amelyek a hippocampus neurogenezisétől függenek 32. Érdekes módon Dániában egy nagy populációval végzett retrospektív kohorszvizsgálat összefüggést mutatott ki a krónikus H. pylori és/vagy gastritis és a Parkinson-kór között 33. A kemokin szint, az eotaxin-1 magasabbnak bizonyult az SPFH egereknél (34. p. Ezért az SPFH egerekben az eotaxin-1 magas szintje arra engedett feltételezni, hogy ezek a kemokinek indikációként szolgálnak. A H. pylori és a normál bélmikrobiota fokozhatja a krónikus gyulladást. Ezért a H. pylori-nek való kitettség a fejlődés korai szakaszában hosszú távú következményekkel járhat az agy fejlődésében. Sajnos nem végeztünk viselkedési vizsgálatokat motoros kontroll vizsgálatok ebben a tanulmányban ennek megerősítésére.

Összegzésképpen: ez a vizsgálat SPF és GF egerekben H. pylori-vel és anélkül azt sugallja, hogy a gyomor kórokozója, a H. pylori kölcsönhatásba lép a normál bél mikrobiotával, megváltoztatva az SPFH egerek metabolikus és gyulladásos útvonalát az SPF egerekhez képest (3. ábra). . Eredményeink arra is utalnak, hogy a H. pylori és a normális bélmikrobiota között folyamatos áthallás van, amely bélgyulladással jár. Korábbi adatok megállapították az okozati összefüggést a H. pylori, a gyomorfekély és a gyomorrák között. Az ebben a tanulmányban bemutatott adatok, amelyek a H. pylori-t összekapcsolják a normál bélmikrobiotával való áthallással, azt sugallják, hogy a H. pylori által közvetített betegségek megjelenése emberben összetettebb. Ezért további kísérletek nagyon garantáltak, különösen az élet első éveiben.

A normál bélmikrobiota fontos szerepet játszik a bél metabolikus hormon homeosztázisának szabályozásában, amely befolyásolja a normális agy és testtömeg fejlődését. Ezenkívül a normális bélmikrobiota is befolyásolja a H. pylori kolonizáció kimenetelét, befolyásolva a bél metabolikus hormonális változásait és a H. pylori által kiváltott gyulladást. .

Teljes méretű kép

Mód

H. pylori törzs és inokulum előkészítése

Ebben a vizsgálatban a C57BL/6 egerekhez adaptált H. pylori törzset (298) használtuk. Ennek a törzsnek a genomja teljesen szekvenálódott 35. Röviden: a H. pylori-t 0,4% élesztő kivonattal és 1% ß-ciklodextránnal (BHYC) kiegészített agyszív infúziós táptalajban tenyésztettük 4 napig, 37 ° C-on, nedvesített inkubátorban, amelynek CO2-tartalma 10% volt. A baktériumok számát 109 baktérium/ml koncentrációra állítottuk be az állatok beoltására.

Állatok és oltás

Kísérletekhez hím SPF és GF C57BL/6 4-6 hetes egereket használtunk. Hím egereket használtak, mert beszámoltak arról, hogy a bél típusú gyomor karcinóma gyakoribb, mint a nőstények 36. Valamennyi egeret (SPF és GF) steril műanyag izolátorokban tartottuk az Országos Rákközpont Központ Germ Free Centerjében (NCC), a SingHealth Kísérleti Orvosi Központban. Az állatokat az R36 Lactamin Chow autoklávban (Lactamin, Svédország) tartottuk, és 12 órás fényciklus alatt tartottuk. Az állatokat négy 12 csoportra osztottuk (SPF, SPFH, GF és GFH). A H. pylori beoltáshoz használt SPF és GF egereket egy éjszakán át éheztettük, és 0,1 ml baktériumtenyészetet intragasztrikusan tápláltunk háromszor, 1 napos intervallummal a táptalajban. A kontrollállatokat ugyanúgy steril BHYC táptalajjal oltottuk be. Ezt követően az egereket 2 héttel (N = 3 csoportonként), 8 héttel (N = 5) és 16 héttel (N = 5) feláldoztuk a kolonizáció után. Egér gyomrokat gyűjtöttünk a H. pylori tenyésztéshez, és plazmát használtunk a hormonok és a citokinek elemzéséhez.

Etikai nyilatkozatok

Valamennyi kísérleti eljárást a SingHealth Intézményi Állattenyésztési és -használati Bizottság (IACUC; Application # 2011/SHS/680) és a National Cancer Center Singapore/SingHealth Biosafety Committee Országos Rákbizottságának előírásaival és irányelveivel összhangban hagyták jóvá és hajtották végre. (IBS); 010/RBC/2011. Számú alkalmazás).

Plazmaminták gyűjtése

A vért lehűtött EDTA-bevonattal ellátott csövekbe vettük, és inverzióval óvatosan összekevertük. A vért 2M 4- (2-aminoetil) benzolszulfonil-fluorid-hidrokloridot (AEBSF, Sigma-Aldrich, Buchs, Svájc) tartalmazó hideg Eppendorf-csőbe vittük 0,2 M végkoncentrációig, és óvatosan összekevertük. A csövet 3000 x g sebességgel 3 percig (4 ° C) centrifugáltuk. A kapott plazmát 1 N sósavat tartalmazó kriotubába adtuk, így 0,1 N végkoncentrációt kaptunk, és -80 ° C-on tároltuk az elemzésig.

Az egér gyomor gyomorából származó H. pylori tenyészetet homogenizáltuk és csokoládé agar lemezekre oltottuk be, amelyeket 7% lizált lóvérrel és szelektív táptalaj esetén trimetoprimmal (5 μg/ml), vankomicinnel (10 μg/ml) egészítettünk ki. nalidixinsav. (20 ug/ml) és amfotericin B-t (5 ug/ml) adunk hozzá. Az összes antibiotikum a Sigma-Aldrich Corporation-től (St. Louis, MO, USA) származott. Az agar lemezeket egyidejűleg inkubáltuk 37 ° C-on, párásított körülmények között, 10% szén-dioxiddal. A H. pylori-hoz hasonló telepeket pozitivitással igazolták ureáz-, oxidáz- és katalázvizsgálatokkal.

Bélhormonok és citokinek multiplex vizsgálata

A Milliplex MAP készletet az egérmetabolikus mágneses gyöngypanelhez (katalógus # MMHMAG-44K; Millipore Corp., MO, USA) nyolc bélhormon számszerűsítésére használták fel, amelyek az élelmiszer-bevitel, az energiafelhasználás és a testtömeg fontos szabályozói: acilezett (aktív ) ghrelin, leptin, aktív amilin, inzulin, aktív glukagonszerű peptid-1 (GLP-1), teljes gyomor-gátló polipeptid (GIP), teljes YY peptid (PYY) és hasnyálmirigy-polipeptid (PP). Egér citokin/kemokin mágneses gyöngyök paneljét (# MPXMCYTO-70K katalógus; Millipore Corp., MO, USA) 32 különböző egér citokin/kemokin panel mérésére használtuk. Plazmát alkalmaztunk, és a vizsgálatokat a gyártó utasításainak megfelelően hajtottuk végre. A mérést a Luminex 200 ™ rendszeren végeztük xPONENT ™ szoftverrel, 3.1-es verzióval (Luminex, Austin, TX, USA).

statisztikai elemzés

A statisztikai elemzéseket az IBM SPSS 22.0 verziójú szoftverrel végeztük. Egyirányú ANOVA (alfa = 0,05) és Tukey őszintén szignifikáns különbség (HSD) post hoc tesztje. Pearson paraméteres korrelációját hajtottuk végre. A p értéke