szindrómát

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Cél:
  • Eredmények:
  • Következtetés:
  • Bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • Kefirkészítés
  • Állattervezés és tanulmányozás.
  • Test felépítés
  • Energiapazarlás
  • Biokémiai markerek meghatározása.
  • Olajvörös folt O
  • Hematoxilin és eozin festés
  • Immunhisztokémiai festés
  • Valós idejű reverz transzkriptáz (RT) -PCR
  • Western Blot elemzés
  • statisztikai elemzés
  • Eredmények
  • A kefir hatása az étrendi bevitelre, a testtömegre, a máj súlyára, az alapanyagcsere sebességére és az energiafelhasználásra
  • A kefir hatása a testösszetételre
  • A kefir hatása a hepatomegaliara és a májkárosodásra
  • A kefir hatása a TG-re és a TC-re
  • A kefir hatása a májfunkcióval járó szérum biokémiai paraméterekre
  • A kefir kezelés hatása a lipid oxidációban és a lipogenezisben szerepet játszó gének expressziójára
  • A kefir elnyomja a lipogenezist
  • Vita
  • Kiegészítő információk
  • Képfájlok
  • 1. kiegészítő ábra
  • Word dokumentumok
  • 1. kiegészítő táblázat
  • 2. kiegészítő táblázat
  • Kiegészítő figura jelmagyarázat

Tárgyak

  • Anyagcsere
  • Alkoholmentes zsírmájbetegség
  • Elhízottság

Összegzés

Cél:

A zsírmáj betegség általában elhízással, inzulinrezisztenciával és cukorbetegséggel társul. A súlyos zsírmájat néha steatohepatitis kíséri, és hepatocelluláris carcinoma kialakulásához vezethet. Jelenleg nincs hatékony kezelés az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) ellen; ezért a legújabb kutatások az ezen állapot kezelésére szolgáló hatékony terápiák kifejlesztésére összpontosítottak. Ennek a tanulmánynak a célja a kefir máj lipid anyagcserére gyakorolt ​​hatásainak értékelése ob/ob egerekben, amelyeket általában a zsíros májbetegségek modellezésére használnak.

Eredmények:

A kaukázusi hegységből származó kefir enyhén alkoholos, savas erjesztett tej. 5 Ezt az italt hagyományosan úgy állítják elő, hogy a tejet kefir gabonával oltják be. A kefirt klinikailag használták gyomor-bélrendszeri betegségek, magas vérnyomás, ischaemiás szívbetegségek és allergiák kezelésére. 5., 6. Számos tanulmány kimutatta a kefir számos biológiai aktivitását, beleértve az antibakteriális, gombaellenes, antioxidáns, antidiabetikus, daganatellenes és immunstimuláló hatásokat. Vujicic és mtsai. 7 azt mutatta, hogy a kefir fogyasztása csökkenti az emberek szérum koleszterinszintjét.

Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a kefir kezelés javította-e a zsírmáj szindróma tüneteit inaktív leptin (ob/ob) génekkel rendelkező egerekben. A lipogenezis útjában szerepet játszó fehérjéket kódoló számos gén, köztük a szterin szabályozó elemet kötő 1-es fehérje (SREBP1), a zsírsav-szintáz (FAS) és az acetil-CoA karboxiláz (ACC), valamint az oxidatív lipid-útvonal, beleértve a A peroxiszóma proliferátorral aktivált a-receptor (PPARα) és a máj-karnitin-palmitoil-transzferáz-1α (CPT1α) kefir-kezelést követően mértük. A tanulmány célja a kefir zsírmáj-szindrómára gyakorolt ​​hatásának és mechanizmusának megértése volt, hogy elősegítse annak alkalmazását a NAFLD modulálásában vagy kezelésében.

Anyagok és metódusok

Kefirkészítés

A kefir starter szemcséket beoltottuk (5%, w/v), és sterilizált tejben szaporítottuk 20 ° C-on 20 órán keresztül, hogy aktiváljuk őket. A szemeket szitán kinyertük, újrakeményítettük (10%, tömeg/térfogat) sterilizált friss tejben, és 20 ° C-on inkubáltuk 20 órán át. 8 A szemek leszűrése után az erjesztett termékeket liofilizátorral liofilizáltuk kefirpor formájában (VirTis, Warminster, PA, USA).

Állattervezés és tanulmányozás.

Test felépítés

Az egész állat testösszetételét a minispec élő egér teljes testösszetétel-analizátorral (LF50) értékeltük TD-NMR-alapú adatok alapján (Bruker Optik, Ettlingen, Németország). Ez a módszer biztosítja az élő egerek zsírjának, zsírjának, szabad folyadékának és vízének pontos mérését.

Energiapazarlás

A közvetett kalorimetriához használt TSE LabMaster-3930 rendszer (Bad Homburg, Németország) kvantitatív számítógépes méréseket végzett az alapanyagcsere és az energiafelhasználás mérésére. Az oxigénfogyasztás (VO 2), a szén-dioxid-termelés (VCO 2) és a légzési hányados (VCO 2: VO 2 arány) kiszámításához nyomon követtük a gázkoncentrációkat a lezárt kamrák be- és kimeneténél. Az O 2 -fogyasztás és a CO 2 -termelés alapján számítottuk a bazális értéket (az éhomi állatok fényciklusa) és a teljes anyagcsere-sebességet (48 folyamatos óra a szabadon táplált állatok esetében). Az etetési epizódokat precíziós mérlegekkel figyeltük és folyamatosan rögzítettük az ételbevitel kiszámításához.

Biokémiai markerek meghatározása.

A GOT, GPT, TC és TC szinteket a szérumban és a májban kolorimetriásan mértük automatizált analizátorral (Beckman-Coulter Synchron LX20 analizátor; Beckman, Fullerton, Kalifornia, USA). 13.

Olajvörös folt O

A fagyasztott májszakaszokat (5–7 µm) 20–30 percig olajvörös O-val festettük, mostuk és 5 percig hematoxilinnel ellenfestettük a máj lipidfelhalmozódásának meghatározása érdekében. A reprezentatív mikroszkópos felvételeket 400-szoros nagyítással rögzítettük mikroszkópra szerelt kamera segítségével.

Hematoxilin és eozin festés

A májszövetet 10% -os pufferolt formaldehidben rögzítettük, és a fent leírt módon hematoxilin és eozin festéssel alkalmaztuk. 14, 15, 16

Immunhisztokémiai festés

A formaldehiddel rögzített és a paraffinba ágyazott szakaszokat 5 um vastagságúra vágjuk, elválasztjuk és vízben lévő alkoholok gradiensén keresztül rehidratáljuk, majd 15 percig forrásban lévő vízzel kezeljük. A metszeteket 3% -os hidrogén-peroxidban inkubáltuk 10 percig az endogén peroxidáz aktivitás blokkolásához, majd egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk primer nyúl SREBP-1 és ACC elleni monoklonális antitestekkel. Az antigén visszaszerzéséhez a metszeteket immunfestéssel készítettük a VECTASTAIN ABC kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) segítségével, a gyártó előírásait követve. A festés kialakulásához diaminobenzidint használtunk, és a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük. 17, 18 A negatív kontroll abból állt, hogy a normál szérumot primer antitesttel helyettesítettük.

Valós idejű reverz transzkriptáz (RT) -PCR

A teljes RNS-t a máj szöveteiből Trizol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk, a gyártó előírása szerint. Két mikrogramm (2 ug) teljes RNS-t szuszpendáltunk 9 ul dietil-pirokarbonáttal kezelt vízben; a komplementer DNS első szálát véletlenszerű primerek és az ImProm-II RT (Promega, Madison, WI, USA) alkalmazásával szintetizáltuk 20 µl össztérfogatban. A reakciót 42 ° C-on 1 órán át hajtjuk végre. A további PCR-amplifikáláshoz az RT-termék alikvot részét (1:10) úgy állítottuk be, hogy 0,1 µg mindegyik primert tartalmazzon, és további puffert adtunk 20 µl össztérfogathoz. A valós idejű RT-PCR-t SYBR Green (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) alkalmazásával hajtottuk végre Rotor-Gene 6000 analizátoron (Qiagen, Germantown, MD, USA). 19 A génexpresszió értékeléséhez valós idejű RT-PCR-t hajtottunk végre öt génnel (PPARα, CPT1α, SREBP1, ACC és FAS), májszövetből származó komplementer DNS felhasználásával. Belső kontrollként a β-aktin kiegészítő DNS-ét használtuk.

Western Blot elemzés

A májszövet fehérje expresszióját Western-blottolással mértük. A májszöveteket 500 μl RIPA pufferben (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1% NP40, 0,25% nátrium-deoxi-cholate, 5 mM EDTA és 1 mM etilén-glikol-bisz (2-aminoetil-éter) homogenizáltuk. -N, N, N, N-tetraecetsav). A homogenizátumokat 12 000 g-vel 30 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. A fehérjét (40 ug) poliakrilamid-gélelektroforézissel 10% -os nátrium-dodecil-szulfáttal elválasztottuk és polivinilidén-difluorid-membránokra elektroblotizáltuk. A membránokat blokkoló oldatban (5% szarvasmarha szérum albumin) inkubáltuk szobahőmérsékleten 2 órán át, majd egy primer antitesttel (SREBP-1, ACC vagy β-aktin) inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. Mosás után a membránokat inkubáltuk kecske nyúlellenes immunglobulin G peroxidázzal konjugált szekunder antitesttel. A membránokat továbbfejlesztett kemilumineszcens Western blot detektáló rendszer alkalmazásával fejlesztettük ki, a fentiek szerint. húsz

statisztikai elemzés

A kísérleti értékeket átlag ± se-ként fejezzük ki. Az összes adatot a t teszttel elemeztük. A statisztikailag szignifikáns eredményeket P # vagy †) vagy P ## vagy †† formában mutatjuk be.

Eredmények

A kefir hatása az étrendi bevitelre, a testtömegre, a máj súlyára, az alapanyagcsere sebességére és az energiafelhasználásra

A 140 mg kg -1 testtömegű kefirrel kezelt leptinhiányos (ob/ob) egerek kevesebb súlyt kaptak a 20-27. Napon, és súlyuk lényegesen kevesebb volt, mint az ob/ob + Mock csoport egerei (a kefir P -1 BW-ja 39 A metabolikus ráta% -os növekedése az ob/ob + színlelt csoporthoz képest (a kefir P –1 BW szignifikánsan megnövelte a teljes napi energiafelhasználást az ob/ob + Mock csoporthoz képest (P –1 Kefir BW növelte a bazális anyagcserét és az összes napi energiafelhasználás és ezáltal csökkent a BW nyereség.

A BW kefir hatásai ( nak nek ), napi bevitel ( b ), az alapanyagcsere sebessége ( c ) és a teljes napi energiafelhasználás ( d ) ob/ob és WT egerekből. Az adatokat átlag ± se * k-k * P –1 BW kefirben szignifikánsan alacsonyabb zsírtartalommal, valamint magasabb sovány és teljes víztartalommal mutattuk, mint az egereknél a kezeletlen ob/ob + Mock csoportban (a kefir P –1 BW csökkentette a hepatomegalia, valamint a zsíros és zsíros májképződés (2b., f. és j. ábra) ezeknél az állatoknál. A máj hematoxilin- és eozinfestése és olajvörös O-festése lipidcseppek felhalmozódását mutatta ki a Mock csoporttal kezelt ob egerek/ob májában (3a. míg a lipidcseppek (makrovezikuláris zsír) ritkák voltak a kefirrel kezelt ob/ob egerek májában (3b, f és j ábra). Azok a WT egerek azonban, akik kapták (3d, h és l. ábra) ill. a nem kapott (3c., g és k. ábra) kefir nem halmozta fel a lipidcseppeket a májban, a hisztopatológiai elemzés szerint.Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ob/ob egerek 4 héten át tartó kezelése 140 mg kg –1 testtömeg kefirrel csökkentette a makrovesikuláris zsír felhalmozódása a májban és a zsírszövetek képződése.

A kefir hatása a máj külsejére, a máj bal lebenyére és ob/ob egerek és a WT egerek zsírszövetére. ( nak nek ), és ) Y ( én ): ob/ob + álcsoport zsírmáj egér modellként; ( b ), F ) Y ( j ): ob/ob + kefircsoport, mint a kezelt zsíros májegerek csoportja; ( c ), g ) Y ( k ): WT + álcsoport normál egér kontrollként; ( d ), h ) Y ( l ): WT + Kefir csoport, mint a kezelt normál egerek csoportja. ( nak nek - d ) Mutassa meg az egér májának külső nézeteit négy különböző csoportból. ( és - h ) Mutassa meg az egerek bal májlebenyét a négy különböző csoportban. ( én - l ) A négy különböző csoportba tartozó egerek zsírszövetének külső nézeteit mutatja. Méretarány = 1 cm.

Teljes méretű kép

A kefir hatásai ob/ob egerekben és WT egerekben a hisztológiailag metszett máj- és zsírszövetek hematoxilin- és eozin- (H&E) és olajvörös O-festésére. ( nak nek ), és ), én ) Y ( m ): ob/ob + szimulált csoport; ( b ), F ), j ) Y ( n ): ob/ob + kefir csoport; ( c ), g ), k ) Y ( vagy ): WT + álcsoport; ( d ), h ), l ) Y ( o ): WT + Kefir csoport. ( nak nek - d ) A képeket 200 × -ra vagy és - l ) 400X. ( nak nek - h ) H&E festés és ( én - l ) A hisztológiai májmetszetek olajvörös O festése. ( m - o ) Zsíros szövettani metszetek H&E festése. Méretarány = 20 μm.

Teljes méretű kép

A kefir hatása a TG-re és a TC-re

( NAK NEK ) A kefir hatása a ( nak nek ) lipidoxidációs gének (PPARα és CPT1α) és ( b ) lipogenezis gének (SREBP1, ACC és FAS) ob/ob egerek és WT egerek májszövetében valós idejű RT-PCR-rel értékelve. A kvantitatív RT-PCR adatokat átlag ± se-ként fejezzük ki (n = 6). * A kefirből származó P ## P ## P –1 BW szignifikánsan csökkent SREBP-1 fehérjeszintet mutatott (140%; P-1 BW kefirből 4 hétig) szignifikánsan csökkentette a BW növekedést, emelte a bazális anyagcserét és a teljes napi energiafelhasználást ( 1. ábra), de ezen paraméterek egyike sem változott a WT egerekben A kezelt állatok gyengített BW-jének oka lehet a csökkent zsírszövetmennyiség és a csökkent adipocita-méret (1. táblázat, 2. és 3. ábra). Következésképpen Ho és mtsai. 21 kimutatták, hogy a kefir az anti-adipogén hatásokat közvetíti az adipocita differenciálódás gátlásán keresztül a 3T3-L1 sejtekben. Ezért ebben a vizsgálatban nyilvánvalóan befolyásolta a több adipocitát tartalmazó ob/ob egerek BW-jét, mint a WT egerek kevesebb adipocitával.

Teljes méretű asztal

A lipid metabolizmus útjának kefir által közvetített modulációjának javasolt mechanizmusa máj/NAFLD szindrómában szenvedő ob/ob egerekben. A kefir ob/ob egerek zsírmájára gyakorolt ​​hatása a lipogén útvonal metabolikus enzimjeinek gátlásán keresztül jelentkezhet, a lipid oxidációs útvonalán nem. A diagram azt mutatja, hogy a kefir gátolhatja az SREBP-1, ACC és FAS fehérjék expresszióját a koleszterin szintézis során.

Teljes méretű kép

Összefoglalva, ez a tanulmány azt mutatja, hogy 140 mg kg -1 testtömeg kefir 4 hétig tartó fogyasztása gyengítette az ob/ob egerek testtömeg-növekedését, valamint a GOT és GPT szérumtartalmát. Ezenkívül a kefir szignifikánsan csökkentette a kezelt ob/ob egerek májszöveteiben az SREBP-1, az ACC és a FAS mRNS és a fehérje expresszióját, valamint csökkentette a zsírsav szintézist, a TG tartalmat és a TC felhalmozódást. Ezért ez a tanulmány kimutatta, hogy az ob/ob egér zsírmáj modellekben a kefir védő hatása a máj lipogenezisének gátlásán keresztül valósul meg, nem pedig a lipidek hasznosításának elősegítése révén.