Összegzés

A Brca1 mRNS kimutatható volt felnőtt szűz nőstény egér emlőmirigy szövetében terhesség és korai laktáció alatt. Az emlő hámsejtjeinek szaporodásának és differenciálódásának fázisaihoz társult, de a Brca1 expressziós mintázata a szűzmirigyben kifejtett jelentős expressziója és az expresszió megszűnése miatt elválasztható volt a valódi differenciálódási markertől, a β-kazeintől. korai csecsemőkorban. . Az elsődleges sejttenyésztési modellben a lamininben gazdag extracelluláris mátrix (ECM) és az emlő hámsejtjeinek társítása szükséges a sejtek túléléséhez és a sejtek differenciálódásához, és elnyomta a Brca1 expressziót ezekben a sejtekben. Az ECM asszociációja jelentősen hozzájárulhat a Brca1 expressziójának végső korlátozásához a szoptató mirigyben in vivo . Érdekes módon az eredményeink arra utalnak, hogy az emlő hámsejtjei apoptózison mennek keresztül, amikor expresszálnak és amikor nem expresszálják a Brca1-et, attól függően, hogy a haldokló sejtpopulációk terminálisan differenciálódnak-e vagy sem.

Hozzáférést a

Bevezetés

A Brca1 egy vagy több alapvető funkciót lát el a korai embriogenezisben, és szükségesnek tűnik az embrionális szaporodáshoz, valamint a csíralemezek és az idegi struktúrák kialakulásához. 38, 40, 41, 42. A sejtproliferáció hiánya alapozza meg a Brca1 (és Brca2) null embriók túlélési kudarcát, és ezt a p21/Waf1 ciklin-függő kináz inhibitor túlzott expressziója is sugallja. 41, 43 A Brca1 expressziója az organogenezis több helyén a későbbi embriogenezisben, valamint számos felnőtt szövetben, például a csecsemőmirigyben, a hereben, az emlő hámjában és a petefészek tüszőiben utal arra, hogy ennek a génnek a terméke (i) vonatkoznak. a fejlődés egy vagy több alapvető folyamatában, és ez kifejeződik a proliferációs helyeken, ahol a differenciálódás hamarosan következik. Ezenkívül a BRCA1 expressziójának kísérleti gátlása a normális és rosszindulatú emlő hámsejtek, de a nem emlő hámsejtek felgyorsult növekedését eredményezte, a 45 és a BRCA1 túlzott expressziója in vitro növekedési retardációt okozott, különösen a daganatos sejtvonalak, emlő és petefészek. 46

A Brca1 beszámolt expressziója a posztnatális emlő hámban pubertás és terhesség alatt 37, 44 arra utal, hogy a géntermék proliferáló és/vagy differenciálódott sejtekben működik. A mai napig a Brca1 gén emlő transzkripciója magasnak bizonyult a terhesség közepén és végén, úgy tűnik, hogy csökken a laktáció és a korai involúció során, de az elválasztás után 5-7 nappal ismét előtérbe kerül. A 37,44 Brca1 expresszióját a tenyésztett sejtekben G1/S-től M47-ig szabályozzák, ami ismét szerepet játszik a proliferációban. Úgy tűnik, hogy az emberi homológ, a BRCA1 és a BRCA2 kifejeződése hasonló a szabályozott sejtciklushoz, megnövekedett mRNS-szinttel a tenyésztett sejtekben a késői G1/S korábbi fázisban, a DNS-szintézist megelőzően. 15, 48, 49 A Brca1 expressziójának up-regulációjának kinetikája az emlő epiteliális aktivitása alatt pubertáskorban és terhességben tükröződik a Brca2-ben. 39, 47

Eredmények

A felnőtt egér emlőmirigy teljes képkockázatának elemzése (1A. Ábra) feltárja a ductalis és az alveoláris rendszerek növekedését a szűz állapottól a terhességtől a laktáció teljes kifejlődéséig: a terhesség közepén bőséges ductalis elágazást és erős kezdeti alveoláris fejlődést figyeltek meg . . Csecsemőkorban teljes alveoláris fejlődést értek el, és a teljes zsírpárna maximális kolonizációja figyelhető meg. Ezek az események a hámsejtek szaporodásának hullámait tükrözik terhesség alatt, és már csecsemőkorban is. Az elválasztás az involzió kezdetét okozza, amely szekvenciálisan magában foglalja az alveolusokban lévő tej szünetelését, az alveoláris hámsejtek intenzív apoptózisának fázisát és végül a mirigyek átalakulásának csökkentését, amely a helyi mátrix metalloproteázának jelentős aktivitásával jár. 52, 53 A teljes 4 napos önkéntelen mirigy-rögzítés jelentős alveoláris regressziót mutat, és ez idővel folytatódik (1A. Ábra és az eredményeket nem mutatjuk be).

mátrix

Teljes méretű kép

Az 1C. Ábra a Brca1 PCR-mérés specificitását mutatja be; az első panel az RT-PCR termék emésztését mutatja egy előre jelzett Ear1 egyedi belső helyen (lásd a rajzot); a második panel az Ear1 emésztési termékek és a megcélzott DNS Southern-blotjának eredményét mutatja egy belső próba segítségével, amely az előrejelzésnek megfelelően kimutatja a cél DNS sávot és a 303 bázis terméket. A harmadik panel egy félig beágyazott PCR eredményét mutatja: sablonként az elsődleges PCR-terméket (535 bp); az oligonukleotid „Southern probe” mint előreindító primer és a PCR primer reverz primerét alkalmazva. Ez a várakozásoknak megfelelően egyetlen 366 bp sávot generál (4. és 5. sáv). Ezért úgy ítéljük meg, hogy a szövetminták és az elsődleges sejttenyészetek alapján a Brca1 RT-PCR termékeink érvényesen tükrözik a sejtes Brca1 transzkriptumokat.

Teljes méretű kép

Összefoglalva, eredményeink három fő következtetésre vezettek minket: (1) hogy a Brca1 expressziója mindkét vizsgált modellrendszerben, in vivo és in vitro (primer sejttenyészet), főként a sejtproliferációhoz kapcsolódik; (2) hogy a Brca1 expressziója mindkét vizsgált modellrendszerben visszaszorul a teljesen differenciált, "túlélő" emlő hámsejtben; Első alkalommal kimutatták, hogy a lamininben gazdag ECM-mel végzett sejtes kölcsönhatás kritikus az elnyomás szempontjából; és (3) hogy a Brca1 expressziója az emlő hámsejtjeinek apoptózisra elkötelezett populációiban eltérhet a sejtek fiziológiai állapotától függően: amikor az apoptotikus populációt korábban összefüggésbe hozták az ECM-mel, a Brca1 expressziója nem figyelhető meg; ahol az apoptotikus populáció nem kapcsolódik a mátrixhoz, a Brca1 expressziója fennmarad.

Vita

Anyagok és metódusok

A naiv (5 hetes), vemhes és szoptató CD1 egerekből boncolt emlőszöveteket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és -70 ° C-on tároltuk az ezt követő RNS előállítás céljából. A negyedik emlőmirigyet (inguinalis) alkalmazták a metakarn-fixált és karmális festésű teljes képkocka-készítéshez, Edwards et al. 50 primer emlő hámsejt tenyészetet állítottunk elő 59, 74, 75, 14–19 napos vemhes CD-1 egerek emlőmirigyéből, a közelmúltban leírtak szerint. 57 „proliferációs” körülmények között 48 órán át tartó növekedés után az „apoptotikus sejtek („ kevesebb ECM ”) populációt szérum és EGF hiányában, valamint ECM (Matrigel) hiányában, de laktogén hormonok és Szérum és EGF hiányában, de ECM (EHS tumorból származó ECM, Matrigel (Becton Dickinson)) és laktogén hormonok tenyésztése céljából „túlélő/differenciált sejteket („ több ECM ”) tenyésztettünk. Ezeket később összegyűjtöttük FACS, FACS/TUNEL sejtciklus-analízishez, teljes RNS-izolációhoz és RT-PCR-elemzéshez. A FACS sejtciklus elemzését a közelmúltban leírtak szerint hajtottuk végre. 57

Rövidítések

emlőrák fogékonyság gén 1

az extracelluláris mátrix

Fluoreszcenciával aktivált sejtválogatás/TdT-közvetített biotitylezett dUTP végcímkézés