Összegzés

Ez a protokoll lehetővé teszi a kutató számára, hogy elkülönítse és jellemezze a különböző gyulladt fókaszövetek rezidens makrofágszövetét, amelyet az anyagcserezavarok étrend által kiváltott modelljeiből nyernek ki.

Absztrakt

Bevezetés

Egérmodelleket használtak az emberi betegségek dinamikájának tanulmányozására. A rezidens sejtek helyes elkülönítése a beteg állapotban lévő egerek szövetétől platformot adhat a betegség patogeneziséhez való molekuláris és sejtes hozzájárulás megértéséhez 1. Az egyik rendellenesség, amely létfontosságú, az elhízás. Az elhízás előfordulása világszerte folyamatosan növekszik, párhuzamosan az inzulinrezisztenciával és a 2-es típusú diabetes mellitusszal, a szív- és érrendszeri megbetegedésekkel és a zsírmáj betegségekkel 2, 3. A túlzott tápanyagfogyasztást inkább torzítja a fizikai aktivitás csökkenése, amely megváltoztatja a zsírszövet jeleit, ami megváltoztathatja más perifériás szövetek, például a máj és az aorta sejtkörnyezetét. A metabolikus homeosztázis ilyen megzavarása krónikus, alacsony fokú szisztémás gyulladást eredményez 5 .

A rezidens klasszikus aktivációja az aortára és a májra, valamint a makrofág fehér zsírszövetbe (WAT) történő felvétele kimutatták, hogy nemcsak a metabolikus jelek diszregulációját indítja el, hanem fenntartja a gyulladást is 6, 7. A makrofágok fenotípusos és funkcionális heterogenitása szorosan összefügg az elhízás patogenezisével, amely társbetegségekhez kapcsolódik. A makrofág polarizáció dinamikus plaszticitása lehetővé teszi, hogy ezek a sejtek különféle aktivált fenotípusokat mutassanak be, amelyek koordinálják a gyulladás progresszióját és feloldódását. Míg a klasszikusan aktivált makrofágok (M1) részt vesznek a gyulladás terjedésében, addig az aktivált makrofágok (M2) összefüggésbe hozhatók a felbontással és a szövetek helyreállításával .

Amint a test metabolikus stressznek van kitéve, a fehér zsírszövet rendellenesen felhalmozódik. A megnagyobbodott zsírszövet vonzza és visszatartja azokat a gyulladásos sejteket, amelyek mélyen megváltoztatják a normális zsírsejtek működését, elősegítve az inzulinrezisztenciát, a hiperglikémiát és a 2-es típusú cukorbetegséget, végül az inzulinrezisztenciát vagy a hiperglikémiát 11, 12. Ezzel párhuzamosan a fehér zsírszövet átalakítása a gyulladásos jelekre reagálva a zsírszövet (M1) klasszikus aktivált makrofágjainak (ATM) beszivárgásával (13, 14). Ez a többsejtű szerv olyan jelek kaszkádját fejti ki, amelyek kisiklják a test többi szervének, például az aortának és a májnak a normális működését 4 .

A máj egy metabolikus erőmű, amely a szorosan szabályozatlan WAT 15 ingereire reagálva alkalmazkodik. A máj-makrofágok vagy a Kupffer-sejtek az anyagcsere-változásokra válaszul gyulladásos citokineket választanak ki, amelyek mind a parenchymát, mind a nem parenchymás sejtfenotípust átalakítják, és elősegítik a szövetek átalakulását. A máj lipidjeinek felhalmozódása, gyulladás, túlzott extracelluláris mátrix lerakódások, nekrózis és esetleges funkcióvesztés követi a gyulladásos inzultusokat, amelyek hozzájárulnak az alkoholmentes zsírmájbetegséghez kapcsolódó májkárosodás széles skálájához 16 17, 18, 18 .

A károsodott WAT és májfunkcióval párhuzamosan a nagy artériák lipideket halmoznak fel az artéria falán, miközben a test krónikus metabolikus stressznek van kitéve 19. Az artériás lipidfelhalmozódás kiváltja az aktivált endothelsejtek kemokin-szekrécióját, és ezt követően monociták toborzását 20. A toborzás után a monociták szaporodnak, differenciálódnak, lenyelik a lipoproteineket és habsejtekké válnak. Az aterogenezist a szövetekben rezidens toborzott és lipidekkel terhelt makrofágok proinflammatorikus aktivitása indítja el és tartja fenn. Az ezen atherogén mikrokörnyezetben továbbított extracelluláris és intracelluláris stressz jeleknek engedve ezek a makrofágok részt vesznek egy apoptózis jelző kaszkádban. Amint ezek a habsejtek elpusztulnak, hozzájárulnak lipidtartalmukhoz, amely kitölti az elváltozás nekrotikus alapját, ami plakkrepedéshez, miokardiális infarktushoz és szélütéshez vezet.

Összességében a makrofág fenotípusok heterogenitása részben szervezi az elhízást, amelyet a normál szövetek, például a WAT, a máj és az aorta 8, 21 gyulladásos változásai okoznak. A toborzott és a rezidens makrofágok jellemzése betekintést nyújthat a potenciális molekuláris célpontokba, amelyek manipulálják az 1. makrofág fenotípust. Az elhízás által kiváltott gyulladt szövetekben a makrofágok hatékony jellemzéséhez egysejtű szuszpenzió nyerhető enzimatikus emésztéssel. Az ilyen disszociációs protokolloknak hatékonyaknak kell lenniük a kötőszövet kellő lebontásában, miközben minimalizálják az immunsejt pusztulását és optimális sejtteljesítményt nyújtanak. Az enzimkeverék függ a szövet típusától és annak szerkezeti felépítésétől. Az ellenálló szövetek, például az aorta a májhoz és a WAT-hoz képest magasabb enzimaktivitást igényelnek a szövetek disszociációjának eléréséhez. A sejtszuszpenzióból a rezidens makrofágok egyértelműen jellemezhetők vagy izolálhatók további downstream analízishez, például transzkripciós profilozáshoz.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az összes kísérleti protokollt (1., 1.2. És 1.3. Szakasz) az Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottság (IACUC) Pennsylvania State University hagyta jóvá.

Szövet Disszociációs pufferek készítése Végső kötet Információ tárolása
Fehér zsírszövet (WAT) Leválasztó puffer: 2,5% HEPES, 10 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumin (BSA), 3 mg/ml (0,3%) II-es típusú kollagenáz Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM) 4,5 g/l glükózzal, L-glutamin és nátrium-piruvát nélkül 500 ml mínusz 80 ° C (10 ml-es alikvotok)
Máj 25 x infúziós pufferkoncentrátum (PBC): 3,55 M NaCl, KCl, 168 mM 240 mM HEPES, 150 mM NaOH desztillált ionmentes vízben H2O 500 ml mínusz 20 ° C (40 ml alikvot)
Tartósító oldat (PRB): 1% BSA 1 x perfúziós puffer 1 L 4 ° C
Leválasztó puffer: 1 x perfúziós puffer 4,76 mM CaCl2-mal és 72 E/ml IV típusú kollagenázzal kiegészítve 50 ml (egérenként) Készítse elő közvetlenül használat előtt
Aorta Leválasztó puffer: 125 E/ml XI típusú kollagenáz, 60 E/ml I típusú hialuronidáz, 60 E/ml DNáz I, 450 E/ml I. típusú kollagenáz, 20 mM HEPES 1 x foszfátpuffer sóoldat (PBS) 500 ml mínusz 80 ° C (10 ml-es alikvotok)

1. táblázat: Specifikus perfúziós szövetpuffer receptek.

1. szöveti disszociáció és izolálás

2. Citometriás áramlás és FACS festés

Fluorofor R-fikoeritrin (PE) PE/cianin (Cy) 7 PE/cianin (Cy) 5 Csendes-óceáni kék (PB)
Lézer (nm) Kék (488 nm)/sárga (561-570 nm) - zöld (532 nm) Kék (488 nm)/sárga (561-570 nm) - zöld (532 nm) Kék (488 nm)/sárga (561-570 nm) - zöld (532 nm) Ibolya (405 nm)
Maximális gerjesztés (nm) 496 496 496 401
Maximális emisszió (nm) 578 785 667 455
Fenotípusos marker F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX integrin, integrin αX lánc, CR4, p150, ITGAX ΑM integrin, Mac-1 Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, ACV
Specifikus cellatípus Rezidens makrofágok Klasszikus aktivált makrofágok (M1) Monociták/makrofágok Leukociták (makrofágok/monociták, limfociták és granulociták)
Dendritikus sejtek részhalmaza Dendritikus sejtek, NK-sejtek, aktivált T-sejtek és a bél intraepithelialis limfociták (IEL) egy része Granulociták, dendritikus sejtek, NK sejtek, valamint a T és B sejtek részhalmazai
Hígítási tényező 1:50 1: 100 1: 100 1: 100
Izotípus kontrollok PE patkány IgG2a PE/Cy7 örmény hörcsög IgG PE/Cy5 patkány IgG2b Csendes-óceáni kék patkány IgG2c

2. táblázat: A fluoroforral jelölt specifikus antitestek felsorolása a rezidens makrofágok megkülönböztetésére.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Apolipoprotein E-hiányos (KO ApoE) C57BL/6 (BL6) egerek 18 héten át magas zsírtartalmú magas koleszterinszintű étrenden (HCHFD vagy HCD) tartva 1 x 104 4 - 2 x 104 CD45 + + F4/80 aorta a makrofágok elkülöníthetők, ha a két mintát összegyűjtjük. A HFHCD KO ApoE-vel táplált egerekből boncolt máj több mint 5x105 rendezett Kupffer-sejtet termelt (ami a válogatásra rendelkezésre álló időtől függ). Amikor magas zsírtartalmú étrendet (HFD) használok a vad típusú (WT) C57BL/6 egerek táplálásához, 5 x 10 5 - 1 x 106 makrofág rezidens zsírszövet (ATM) rendelhető a stromalis vaszkuláris frakcióból (SVF). Az adott szövetből megrendelhető makrofágok fent említett száma alkalmas volt a valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (qPCR) génexpressziós elemzésre. Azoknál a szöveteknél, ahol a makrofágpopuláció kevesebb része nyerhető ki, például az aorta esetében, ajánlott Co-szennyezőket (például glikogént) és éjszakai kicsapást használni, amikor az RNS izolálása szükséges ezekhez az elemzésekhez.

jellemzése

2. ábra: KO ApoE egerek boncolt emésztett májából rendezett Kupffer sejtpopulációk génátírási profilja 18 hétig HCD-ben. (NAK NEK) Általános sémablokkok a Kupffer-sejtpopulációk jellemzésére és osztályozására. (B) Ron expresszáló (Ron +) és nem expresszáló (Ron -) rendelt CD45 ++ F4/80 makrofágok gén expressziójának elemzése kvantitatív RT PCR-rel. A diákok t-teszt elemzéseit statisztikai szoftverrel végeztük, és az értékeket átlag ± SEM-ként ábrázoltuk. P 31. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


3. ábra: A WT BL6 egerekből boncolt fehér zsírszövetből izolált ATM jellemzése HFD-vel 18 hétig. Általános blokkséma (NAK NEK), a makrofágpopulációkból származó zsírszövet jellemzésére és osztályozására (B) A Ron + sejtek százalékos aránya az F4/80 CD45 + + CD11c-jében - és az F4/80 CD45 + + CD11c + a WAT-ból rendezett makrofág-populációkban. Az ábrát Yu és munkatársai módosították. (2016) 31. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

A szerzőknek nincs összeférhetetlenségük.