Tárgyak
Összegzés
A tengeri szivacsok ősi, kocsánytalan, szűrővel táplálkozó metazoanák, amelyek a világon élő bentikus közösségek fontos alkotóelemét képviselik. A szivacsok figyelemre méltó baktériumok sokféleségét hordozzák magukban, de keveset tudunk az ilyen baktériumok szimbiontusainak funkcionális tulajdonságairól. Ebben a tanulmányban bemutatjuk a Cymbastela concentrica szivaccsal társított nem tenyésztett δ-proteobaktérium genomiális és funkcionális jellemzését. Megmutatjuk, hogy ez a szervezet új filogenetikai kládot képvisel, és javasoljuk, hogy egy cianobaktériummal együtt éljen. Áttekintést nyújtunk ezen δ-proteobaktérium előre jelzett funkcionális és ökológiai tulajdonságairól is, és megvitatjuk annak komplex kölcsönhatásait a környező sejtekkel és a környezettel, beleértve a sejtek kötődésének, a tápanyagok transzportjának és a fehérje-fehérje kölcsönhatásnak a tulajdonságait.
Bevezetés
Anyagok és metódusok
Filogenetikai elemzés
A prote-proteobaktériumok 16S rRNS génszekvenciájának kezdeti taxonómiai osztályozását Bayes-féle osztályozó algoritmussal végeztük, előre meghatározott paraméterekkel a Ribosomal Database Projectben (Wang et al., 2007; Cole és mtsai, 2009). Az rS-proteobakteriális 16S génszekvencia legközelebbi szomszédos szekvenciáit (mind a nem tenyésztett, mind az izolált képviselők számára) a Ribosomal Database Project 10-es verziójából nyertük ki a seqmatch függvény segítségével, majd a SINA web-alignerrel igazítottuk (Pruesse et al., 2007) . Filogenetikai fát készítettünk a maximális valószínűség algoritmus felhasználásával, teljes hosszúságú 16S rRNS génszekvenciákkal (> 1200 nt) az ARB szoftvercsomagban (Ludwig és mtsai, 2004). A nagymértékben változó régiók összehasonlításhoz történő felhasználásának elkerülése érdekében parsimony helyzetváltozó maszkot (pos_var_Bacterias_94) és felhasználóspecifikus végső maszkot használtak, amelynek eredményeként 1178 nukleotidot hasonlítottak össze a fa konstrukciójában. Tanulatlan euryarchaeote. (Genbank Accession: AB077227) külső csoportként használták a fa építésénél.
Genomikai és összehasonlító genomrekonstrukció.
A proteobaktérium fajok részleges genomját a C. concentrica szivacs baktériumközösségéből származó sörétes szekvenálási adatok összegyűjtésével rekonstruáltuk (Thomas és mtsai, 2010). A 20 kb-nál nagyobb szekvenciájú állványok csoportosítását a stratégia Woyke és munkatársai által leírt módosításának megfelelően végeztük. (2006) és Thomas és mtsai. (2010), és részletesebben a Kiegészítő információk ismerteti.
A δ-proteobaktérium lokalizációja
A C. concentrica tengeri szivacs mintáit az augusztusi Sydney-ben, a Bare Island közelében található Botany-öbölben (S 33.59.461; E 151.13.946) gyűjtöttük össze 2009 augusztusában. A gyűjtést követően a C. concentrica szövetet kalciummal és magnézium nélkül. tengervizet (25 g NaCl, 0,8 g KCl, 1 g Na2S04, 0,04 g NaHCO3/1 l), és azonnal átvisszük egy 15% -os szacharóz-oldathoz. A mintákat 1 órán belül visszajuttattuk jégen a laboratóriumba. A fluoreszcens in situ hibridizációt (FISH) a kiegészítő információkban leírtak szerint végeztük validált próbákkal, amelyek általában baktériumokat és specifikusan a δ-proteobaktériumokat célozták meg.
Eredmények és értékelésük
A szivaccsal társult baktériumok új, acter-proteobakteriális kládja
A C. concentrica és rokon organizmusaiból származó δ-proteobaktérium 16S rRNS génszekvenciájának maximális valószínűségi fája. A fát a 16S rRNS gén 1178 nukleotidjára építették. Tanulatlan euryarchaeote. (AB077227) külső csoportként használtuk az elemzéshez (a fán nem látható). A skála sáv 0,1 nukleotidváltozást (10%) mutat per nukleotidpozíció. U, műveletlen; Én, az elszigeteltség.
Teljes méretű kép
A prote-proteobaktériumok szivaccsal társított csoportja szintén különbözött a Desulfuromonas és Bacteriovorax nemzetségektől, a divergencia szintje 24, illetve 30% volt. A Desulfuromonas nemzetség olyan vízi fajokat tartalmaz, amelyekről ismert, hogy anaerob módon nőnek az acetát oxidációja és az elemi kén vagy Fe (III) egyidejű redukciója révén (Pfennig és Biebl, 1976). A Bakteriovorax fajok parazitálnak más gram-negatív baktériumokban, és nagyon mozgékony, szabadon élő extracelluláris fázisuk van, amelynek során új gazdaszervezeteket keresnek. Ennek a nemzetségnek a fenotípusos jellemzői megegyeznek a Bdellovibrio jellemzőivel, és a Bacteriovoraxot a közelmúltban a 16S rRNS génen alapuló filogenitás alapján külön nemzetségbe sorolták át (Baer et al., 2000, 2004).
Az itt elvégzett filogenetikai elemzés azt mutatta, hogy a C. concentrica δ-proteobaktériumok valószínűleg új nemzetséget vagy családot képviselnek, és hogy ennek a még tenyésztendő baktériumcsoportnak a tagjai szivacsokkal vannak összefüggésben.
A proteobaktérium szivacs funkcionális genomi összehasonlítása a rokon baktériumokkal
Genom funkcionális összehasonlítás a δ-proteobacterium parciális genom COG kategóriái és a B. bakteriovorus HD100 genom genomjai alapján ( nak nek ) és D. acetoxidans DSM684 ( b ). Az Y tengely a mediánértéket mutatja, szignifikáns −2 és 2 cut-off értékkel.
Teljes méretű kép
Annak megértése érdekében, hogy a prote-proteobacterium genom bizonyos funkcióinak közös evolúciós története van-e a kapcsolódó genomokkal, az összes fehérjét taxonómiailag osztályozzuk egy alacsonyabb közös ősi algoritmussal, amelyet a MEGAN-ban hajtottak végre (Huson et al., 2007). 663 fehérje taxonómiai elemzése azt mutatta, hogy 249-et a B. bakteriovorus HD100-hoz, 4-et a D. acetoxidans DSM684-hez rendelhettek, 185-nek nem volt találata a nem redundáns GenBank adatbázisban, és a többi fehérjét különböző szinteken, a baktériumokon belül vagy egyszerűen sejtes organizmusok (S4 kiegészítő táblázat). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a prote-proteobaktérium genom konzerváltabb fehérjékkel rendelkezik a B. bakteriovorus HD100 genommal, mint bármely más rendelkezésre álló genom.
Ez azt mutatja, hogy a sejtfal biogenezise a kötődés és a mozgékonyság mellett a proteobacterium szivacs és a B. bakteriovorus evolúciósan konzervált funkciója is. .
A prote-proteobaktérium szivacs sejtekkel kapcsolatos életmódot mutat
A mozgékonyságban, a kötődésben és a sejtfal biogenezisében tapasztalt hasonlóság a B.acter bakteriovorus-szal szemben arra a feltételezésre késztetett bennünket, hogy a proteobaktérium szivacs asszociációt alkothat (potenciálisan ragadozó jellegű) más baktériumsejtekkel is. Ezért fluoreszcens in situ hibridizációval vizsgáltuk az ob-proteobaktérium fizikai helyét a szivacsban. A bakteriális doménhez tartozó szonda (EUB338) segítségével először nagyszámú baktérium jelenlétét mutattuk ki a C. concentrica szivacsban (3a. Ábra). A δ-proteobaktérium 16S rRNS-szekvenciájára irányított szonda kicsi (3 µm hosszú) sejtek kimutatását eredményezte, és csak alkalmanként találtak szabadon élő sejtként (3b. És c. Ábra). A δ-proteobaktérium relatív arányát a teljes mikrobiotához viszonyítva 6,4% ± 1,8% -ra becsülték (lásd Kiegészítő információk), ami hasonló az al δ-hez tartozó három 16S rRNS gén PCR könyvtárban található szekvenciák 2,2% ± 0,8% -ához - proteobaktérium (Thomas és mtsai, 2010). A prote-proteobaktériumok elhelyezkedése gyakran a nagyobb auto-fluoreszcens sejtek végén volt.
Teljes méretű kép
Az auto-fluoreszcens „gazdasejtek” zöld autofluoreszcenciát mutattak, amikor 488 nm-es fénnyel gerjesztették őket, ami összhangban van a cianobaktériumok, a diatomák és a dinoflagellátumok esetében jelentett fluoreszcenciával (Tang és Dobbs, 2007). Annak megállapítására, hogy az auto-fluoreszcens sejtek eukarióta (azaz diatómák vagy dinoflagellettek) vagy baktériumok (azaz cianobaktériumok) voltak-e, további FISH elemzést végeztünk kétszondás hibridizációs terv alkalmazásával, proteoproteobaktériumra specifikus Cy3-jelölt próbával és fluoreszcein-izotiocianáttal -jelölt baktérium-specifikus szonda. A 3d. Ábra azt mutatja, hogy az auto-fluoreszcens sejtek reagáltak az általános bakteriális próbára. Ezért az adott autofluoreszcencia és a baktériumokra specifikus próba megkötése alapján ezek a sejtek valószínűleg cianobaktériumok. Ez a megállapítás összhangban áll egy 30 évvel ezelőtti megfigyeléssel, amelyet Wilkinson (1979) tett, és elektronmikroszkópia segítségével "Bdellovibrio-szerű" részecskéket talált a két korallszivacs, a Neofibularia irata és a Jaspis stelifera mezoiljában található egysejtű cianobaktériumokon belül. .
A δ-proteobaktérium szivacs várható funkcionális tulajdonságai
Az új proteobaktérium funkcionális tulajdonságainak jobb megértése érdekében gondosan, manuálisan elemeztük részleges genomját a fiziológiai és ökológiai funkciók szempontjából.
Meghatároztuk a terminális enzim alegységeit az aerob légzési láncban, a citokróm C-oxidázt a parciális genomban (1108814258778_ORF0001). A proteobaktérium szivacs tehát képes aerob módon növekedni; tovább megkülönböztetve a rokon szigorúan anaerob Desulfuromonas fajoktól.
Az AR és TRP fehérjéket kódoló ORF-ek sematikus ábrázolása a 110814258323 δ-proteobaktérium állványban. Az ORF-ek relatív nukleotidpozíciójú nyilakban vannak feltüntetve.
Teljes méretű kép
Következtetések
Kultúrától független megközelítések révén azonosítottunk és jellemeztünk egy új proteobaktériumot, amely esetleg új nemzetséget vagy családot képvisel. Tudomásunk szerint ez a szivaccsal társult organizmus csak a gazda asszociált prote-proteobaktériumok harmadik csoportját képviseli. Azt javasolják, hogy a proteobaktérium szivacs a cianobaktériumokkal együtt éljen, és valószínűleg hatással legyen fotoszintetikus gazdaszervezetének fiziológiájára. Ez pedig következményekkel járhat a szivacsgazdára nézve, amely gyakran fotoszintetikus szimbiontusokat tartalmaz, és ezért fotoszintetikusan rögzített széndioxidot nyer (Venn et al., 2008). Az itt leírt tenyésztetlen δ-proteobaktériumok funkcionális genomi jellemzése szintén komplex kölcsönhatásokat jelez a környező sejtekkel és a környezettel. Ez a tanulmány betekintést nyújt a szivacs többszintű kölcsönhatásaiba, amely gazdasejtként szolgál a cianobaktérium számára, amely viszont a prote-proteobaktérium gazdája.