Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

Itt meghatározzuk az ASD-vel kapcsolatos de novo mutációk nagy csoportját a Trio Rac1 aktivációs tartományában, a GEF1. A Trio GEF1 doménjében talált mutációs klaszterezés mértéke és ezen ASD-vel kapcsolatos de novo mutációk számítási szempontból előre jelzett hatása a Trio-Rac1 kölcsönhatásokra utal a Trio-Rac1 útvonal deregulációjának erős kapcsolatára az ASD-vel kapcsolatos patológiákban. Ezeknek a mutációknak a szisztematikus vizsgálata a Trio-9-ben olyan hipomorf és hipermorf mutációkat tár fel, amelyek drámai módon és kétirányúan befolyásolják a Trio működését, valamint a Trio glutamaterg neurotranszmisszióra gyakorolt ​​hatását a hippocampus CA1 piramissejtjeiben. A TEA állatmodelljei a glutamaterg neurotranszmisszió kóros növekedését és csökkenését mutatják 17, 18, 19. Vizsgálatunk az ASD-hez kapcsolódó missense mutációkat fedezi fel egyetlen szinaptikus Rac1 aktiváló fehérjében, amely kétirányú változásokat idézhet elő a glutamaterg neurotranszmisszióban, és ezáltal a csökkent és túlzott Trio aktivitást, valamint az ebből következő szinaptikus diszfunkciót vonhatja maga után G-vel kapcsolatos betegségben.

Eredmények

TEA-val kapcsolatos mutációk a Trióban

autizmus

Az ASD-vel kapcsolatos de novo mutációk a trióban. missense mutációk, b hülyeség és másolat száma c trióban ASD-vel kapcsolatos rendellenességekben szenvedőknél. A különféle fehérje doméneket az N kifejezéssel kezdve jelezzük: Sec14 domén, Spectrin ismétlések, GEF1 domén (Dbl homológiai doménből (DH1) és Pleckstrin homológiai doménből (PH1) áll), Src 3. homc domén (SH3), és a GEF2 domén (egy Dbl (DH2) homológiai doménből és egy Pleckstrin (PH2) homológiai doménből áll). Minden mutációhoz megadják az egyén diagnózisát, valamint a trio aminosav szekvencia megváltoztatására vonatkozó információkat. Az NP_009049.2 aminosavmutációinak helyzete

Teljes méretű kép

A közelmúltbeli Exome Aggregation Consortium (ExAC) elemzése szerint 60 706 teljesen szekvenált emberi genom alapján a TRIO a 60 legkorlátozottabb emberi gén egyike, ami nagy funkcionális jelentőségre utal. A triónak kivételesen alacsony a nonszensz mutációk (z = 6,29) és a funkcióvesztés (LoF) értelmetlen mutációinak aránya (pLi = 1), míg a szinonim mutációk átlagos aránya (z = 0,19) 27. Még meglepőbb a GEF1/DH1 domén korlátozása. Nevezetesen, nem figyeltünk meg missense vagy funkcióvesztés (LoF) mutációkat a GEF1/DH1 doménben 9 937 24 kontroll genomban (1. táblázat és 2a. Ábra), ami jelzi az ASD-vel kapcsolatos mutációk erős gazdagodását ebben a régióban ( 2b. Ábra). Nem találtunk missense mutációkat sem a GEF1/DH1 tartományban az 1000 Genom 28 adatbázisában (Kiegészítő 1a. Ábra). Fontos, hogy az 1000 Genom adatbázisban felsorolt ​​szinonim mutációk jelen voltak ebben a régióban (Kiegészítő 1b. Ábra). Ezek az adatok együttvéve az ASD-vel kapcsolatos de novo mutációk erőteljes gazdagodására utalnak Trio GEF1/DH1 régiójában.

Teljes méretű asztal

A kontroll és az ASD-vel kapcsolatos genomokban talált trio mutációk. nak nek A kontrollgenomokban talált trio-9 mutációk (De Rubeis és mtsai., 2014 24). b A grafikon mutatja az ASD-vel kapcsolatos (piros sávok) és a kontroll (fekete sávok) mutációk számát, amelyek a Trio-9 minden tartományában megtalálhatók ASD-vel kapcsolatos rendellenességekben szenvedő egyénekben, illetve ASD-vel kapcsolatos rendellenességekkel nem rendelkező kontroll személyeknél. Az ASD-vel kapcsolatos Trio-mutáció dúsulását minden Trio-doménben kiszámítottuk, levonva a kontrollmutációk számát az egyes doménekben megfigyelt de novo ASD-vel kapcsolatos mutációk számából. Az átlátszó háromszögek szemléltetik az ASD-vel kapcsolatos mutációgazdagodás jelenlétét (piros), hiányát (fekete) és nagyságát az egyes tartományokban.

Teljes méretű kép

A Trio fehérje és a Trio-GEF1/DH1 domén mutációk fontosságának felmérése ASD-vel kapcsolatos rendellenességekben összehasonlítottuk a de novo mutációk várható számát a megfigyeltekkel. Samocha és mtsai által kifejlesztett mutációs modellt használjuk. 29. Samocha és mtsai eredményei. 1078 ASD-es és 151 értelmi fogyatékossági eseten alapultak, és ez a tanulmány az SCN2A-t és a SYNGAP-ot azonosítani tudta az ASD-vel kapcsolatos rendellenességekben. Jelen tanulmányban sokkal nagyobb eseteink száma (4890 az ASD-vel kapcsolatos rendellenességek esetén) és a TRIO-ban azonosított missense mutációk nagy száma (11 ASD eset, szemben az általános populációban ugyanannyi egyedre várt 1,07 esettel) ) drámai módon javult a statisztika, ami a TRIO és az ASD-szerű szindrómák rendkívül jelentős teljes genom-társulását eredményezte (P-értéke −8; 3. kiegészítő táblázat). Még erősebb összefüggést találtunk az ASD-vel kapcsolatos szindrómákkal a TR1 GEF1/DH1 aldomainjében, amelyek kölcsönhatásba léptek a Rac1-gyel (7 eset a 0,06 várható P -13 értékhez képest; 3. kiegészítő táblázat).

Az előrejelzések szerint a Trio ASD-mutációi megváltoztatják a Rac1-aktivációt

Az ASD-hez kapcsolódó DH1 mutációk várható hatása a Rac1 aktiválására. A GEF1 domént a teljes fehérje összefüggésében fentebb mutatjuk be, a GEF1 domént szaggatott piros négyzettel azonosítjuk. Az alábbiakban áttekintjük a Trio-GEF1 és a Rac1 komplex szerkezetét, a két interaktív fehérjét kék, illetve narancssárga rajzfilmként mutatjuk be (Protein Data Bank kód: 2NZ8). Az ASD-vel kapcsolatos betegség mutált aminosavmaradékai bíborszínű szénatomot tartalmazó gömbökként vannak feltüntetve. A megnövekedett inszerciók kölcsönhatást jelentenek a vad típusú és mutáns fehérjék aminosavmaradékai között. A vad típusú maradékokat bíborszínű szénatomokkal jelölik és oszlopos ábrázolással mutatják. A mutált aminosavakat zöld vagy sárga szénatomok mutatják. A hidrogénkötéseket/sóhidakat szaggatott vonalak jelzik. A GEF1-Rac1 kölcsönhatásokban résztvevő vízmolekulákat átlátszó vörös gömbök jelzik

Teljes méretű kép

Teljes méretű asztal

A Trio-9 I1329HLAL * expressziója gátolja a szinaptikus funkciót

Teljes méretű kép

40% az AMPAR-eEPSC amplitúdójában (4h, j. Ábra). A Trio-9 I1329HLAL * expresszió nem volt hatással az NMDAR-eEPSC amplitúdójára (4i., K. Ábra). Ez a fenotípus rendkívül hasonló volt az shRNS Trio-val megfigyelthez. A páros pulzus megkönnyítését (PPF) a Trio-9 I1329HLAL * posztszinaptikus expressziója sem módosította, jelezve, hogy ennek a mutánsnak az expressziója nem befolyásolta a preszinaptikus glutamát felszabadulást (4l. Ábra).

A Trio-9 K1431M expressziója gátolja a szinaptikus funkciót

Ezután megnéztük a Trio missense mutációt, a Trio-9 K1431M-et. A mutációt hordozó egyén súlyos autista tüneteket és értelmi fogyatékosságot mutatott. Megjegyzendő, hogy egy korábbi vizsgálat, amely alanin-szkennelési mutációkat használt a Trio GEF1 régiójában található fontos maradékok azonosítására, azonosította ezt a maradékot az R1428-mal együtt a Rac1-aktiváció szempontjából kritikus 36-ban. A K1431M mutáció modellezésével a víz és a hidrogén által közvetített számos kölcsönhatás megszakadását jósoltuk, ami csökkentett affinitást eredményezett a Trio és a Rac1 GEF1/DH1 doménje között (3. ábra és 2. táblázat). A FLIM elemzés feltárta, hogy a Trio-9 K1431M, hasonlóan a Trio-9 I1329HLAL * -hoz, súlyosan csökkentette a Trio-9 azon képességét, hogy aktiválja a Rac1 bioszenzort HEK293 sejtekben (5b. Ábra). Ezért, mint előre jeleztük, ez a mutáció erősen csökkentette a Rac1-aktivációt. Ezután a Trio-9 K1431M-et expresszáltuk CA1 piramis idegsejtekben, és megállapítottuk, hogy a Trio-9 K1431M fenokópizált Trio-9 I1329HLAL *. A Trio-9 K1431M csökkentést eredményezett

50% az AMPAR-eEPSC amplitúdóban (5c. Ábra), amelyet valószínűleg a néma szinapszisok növekedése is okoz, mivel a kvantumtartalom csökkenése következtében nem változott az NMDAR-eEPSC amplitúdója vagy nem változott a PPF (5d-f. Ábra) . Mint a vad típusú Trio-9 esetében, az NMDAR-eEPSC amplitúdóinak variációja a Trio-9 K1431M-et expresszáló neuronokban a kvantumtartalom variációjának volt köszönhető (Kiegészítő 4c. Ábra). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a Trio-9 K1431M, mint a Trio-9 I1329HLAL *, valószínűleg szinapszisokban versenyez az endogén vad típusú Trio-val, és az AMPAR szinaptikus funkciójának csökkenését eredményezi. Továbbá azt tapasztaltuk, hogy a Trio GEF1 doménjében bekövetkezett nonszensz mutáció, amelyet ASD (Trio-9 S1575N) 28 nélküli egyénnél azonosítottak, nem befolyásolta a Trio-9 képességét az AMPAR-eEPSC amplitúdójának növelésére az idegsejtekben. piramis CA1 (Kiegészítő 1a. és 5. ábra).

Teljes méretű kép

A Trio-9 P1461T expressziója gátolja a szinaptikus funkciót

Teljes méretű kép

A Trio-9 D1368V Trio hiperfunkciót eredményez

A Trio mutációk és az ASD specifikus társulását annak szoros paralógjának, a Kalirinnek az elemzése támasztja alá, amelynek egyedülálló fejlődési expressziós profilja van. Az ASD-hez kapcsolódó missense mutációkat nem figyelték meg Kalirinben, annak ellenére, hogy hasonló szerepet játszottak a glutamaterg szinapszis szabályozásában. A trió nagyon kifejeződik a korai posztnatális fejlődésben, és 10 éves korával csökken. Ezzel szemben Kalirin kifejezése csak a 11., 12. serdülőkorban éri el csúcspontját. Meg kell jegyezni, hogy a Kalirin funkciója szerepet játszik a későn megjelenő neuropszichiátriai rendellenességekben, mint például a skizofrénia és az Alzheimer-kór 38, 39, 40, 41. A Kalirin GEF1/DH1 doménjében értelmetlen mutációt találtak, amely gátolta a Rac1 aktiválódását egy skizofréniában szenvedő egyénben is 39. Ezért úgy tűnik, hogy a Trio és a Kalirin expressziós profilja egybeesik azoknak a betegségeknek a megjelenési korával, amelyekben érintettek, és arra utalnak, hogy a Rac1 által közvetített szinaptikus szabályozás zavara az agy különböző fejlődési idejeiben különböző agyi betegségekhez vezet. .

A közelmúltban kiderült, hogy a szinaptikus Rac1 által közvetített aktin-szabályozás zavarai alapozzák az ASD-vel kapcsolatos viselkedési fenotípusok kialakulását az ASD-vel kapcsolatos betegségek jól bevált állatmodelljeiben 5, 6, 7. Egy nemrégiben elvégzett tanulmány a Rac1-et számos ASD kockázati gén valószínű konvergenciapontjának is meghatározta 8. Itt azonosítjuk a szinaptikus aktin szabályozó fehérje, a Trio Rac1 aktivációs doménjét, mint az ASD-vel kapcsolatos de novo mutációk hotspotját. Mivel a glutamaterg neurotranszmisszió szabályozatlanságáról feltételezik, hogy az ASD számos állatmodelljében a viselkedési fenotípusok alapulnak, és mivel a Trio-aktivitás utáni fehérjékről nem találták, hogy jelentős ASD-vel kapcsolatos mutációkat hordoznának, csábító spekulálni, hogy a megváltozott Trio-funkció egy fő pontot jelent az ASD kialakulásához vezető számos tényező konvergenciája. A továbbiakban meg kell határozni a megváltozott Trio funkció prevalenciáját ASD-ben szenvedő egyéneknél, és meg kell állapítani, hogy alkalmazható-e Trio-val kapcsolatos terápia az ASD-vel kapcsolatos viselkedési fenotípusok visszafordítására a betegségben szenvedő betegek jelentős számban.

Mód

Mutációs modellezés

A mutációk stabilitásra és kötődésre gyakorolt ​​hatását a Trio GEF1 Rac1 komplex nagyfelbontású kristályszerkezetével jósoltuk (2NZ8 PDB kód). A számításokat ICM molekuláris modellező szoftver (Molsoft LLC) segítségével hajtottuk végre. A mutáns fehérje konformáció energiaoptimalizálását torzított valószínűségű Monte Carlo algoritmus alkalmazásával hajtottuk végre. A fehérje stabilitásának ∆∆ G stabilitása (1) és a fehérje kötése binding G kötése (2) szabad energiaváltozását ezután a mutáns és a vad típusú fehérje összecsukódó vagy megkötő szabad energiájának különbségeként számoltuk:

Azok a mutációk, amelyek bindG kötődése> 2 vagy ∆∆G stabilitása> 2 volt, a Rac1 Trio-aktivációjának zavaró hatásának számítottak.

Kísérleti konstrukciók

Az emberi Trio-9-et (vagy a 13. hivatkozásban szereplő Trio-9-et) egy Trio-FL cDNS-ből állítottuk elő, amelyet Dr. Betty A. Eipper (Connecticuti Egyetem) bőségesen biztosított. Az ASD-hez kapcsolódó Trio mutációkat Trio-9 cDNS-ből készítettük átfedés-kiterjesztésű PCR alkalmazásával, majd In-fúziós klónozással (Clontech). Valamennyi plazmidot DNS-szekvenálással igazoltuk. A trio-9 cDNS-eket IRES-mCherry-t tartalmazó pCAGG-vektorba klónoztuk. A csak GFP-t expresszáló pFUGW vektort pCAGG-IRES-mCherry konstrukciókkal együtt expresszáltuk a transzfektált idegsejtek azonosításának fokozása érdekében, és ezt használtuk kontroll vektorként a gerinc képalkotásához. A Rac1 bioszenzor konstrukció a pTriEx-HisMyc gerincen belül volt, korábban a ref. 30 és Dr. Jaap D. van Buul (Sanquin) bőkezűen biztosította.

HEK293 sejttranszfekció

A HEK293T sejteket (ATCC) DMEM-ben 10% FBS-sel tenyésztettük 5% CO 2 -ot tartalmazó 37 ° C-os inkubátorban. A sejteket Matrigellel bevont, 35 mm-es üvegfenekű lemezekre szélesztjük. A sejteket 50% -os összefolyásig növesztettük, mielőtt a Trio-9 expressziós konstrukcióval transzfektáltuk volna a Rac1 bioszenzorral együtt, FuGENE HD transzfekciós reagens alkalmazásával. 1: 1 Trio-9/Rac1 bioszenzor DNS arányt alkalmaztunk. A lemezes sejteket 16 órán át inkubáltuk a transzfekciós keverékben, majd friss táptalajjal helyettesítettük. HEK293 kísérleteket hajtottunk végre

20 órával a transzfekció után.

Élettartamú fluoreszcencia képalkotás (FLIM)

$$ E = 1 - \ tau DA> \ tau D $$

A FRET bioszenzor fázisát az aktivátor hiányában független készítményből nyertük. A kioltott donornak megfelelő fázist a (3) kioltási egyenlet alapján számítottuk ki. Az összes lehetséges fázis helyzete, amelyet különböző hatékonysággal csillapítanak, egy görbe pályát írnak le a fázis-ábrán. Egy adott pixel fázisának kísérleti helyzete a pálya mentén meghatározta a kioltás mértékét és ezáltal a FRET hatékonyságát. A háttér és az akceptor nélküli donor hozzájárulását a 49, 52 lineáris kombináció szabályának alkalmazásával értékelik, a háttérfázist és a donort nem csillapítva függetlenül határozzák meg. Az összes fázis transzformációt és a FLIM adatok adatelemzését SimFCS szoftverrel (Kaliforniai Egyetem, Irvine) végeztük.

Elektrofiziológia

Gerincsűrűség-elemzés

A gerincsűrűség elemzéséhez P6 patkány kölykökből készült organotipikus hippokampus szelet tenyészetekben kontroll és kísérleti CA1 piramis idegsejteket biolisztikusan transzfektáltunk FUGW-GFP és pCAGGS-IRES-mCherry konstrukciókkal a lemezezés után kb. 18–20 órával. A képeket a DIV 7-nél szuperfelbontású mikroszkóppal (Elyra Microscope System, Zeiss) készítettük. A rendelkezésre álló invertált mikroszkóppal és olajimmerziós objektívlencsével történő alkalmazáshoz a szeleteket 4% PFA/4% szacharóz PBS-ben rögzítettük és háromszor PBS-sel mostuk. A GFP szignál erősítése érdekében a szeleteket blokkoltuk, majd 3% BSA-ban, 0,1% Triton-X-et tartalmazó PBS-ben permeabalizáltuk, és GFP elleni elsődleges antitesttel (2 μg/ml, Life Technologies A-11122) festettük, majd PBSTx-ben mostuk és festettük. Alexa 488-konjugált szekunderrel (4 μg/ml, Life Technologies A-11034). A szeleteket tovább dolgoztuk egy rövidített SeeDB-alapú 55-ös protokollal, hogy megpróbáljuk csökkenteni a gömbös aberrációt. A szeleteket ezután SlowFade Gold-ba (Life Technologies) szerelték fel képalkotás céljából. A Z-kötegeket 30 µm szekunder apikális dendrit szakaszokból készítettük

30 µm-re a szómától. A képeket 100 × olajobjektívvel (100 ×/1,46) készítettük SIM módban, a mellékelt 42 μm-es SIM-rács segítségével, és a mellékelt szoftver (Zen, Zeiss) segítségével feldolgoztuk és rekonstruáltuk. Egy kísérletező, elvakítva a kép állapotát, képelemzést végzett az egyes szakaszokon az ImageJ alkalmazásával a dendrittől oldalirányban kinyúló tüskék számlálásához.

Statisztikai elemzés

A Trio ASD-vel kapcsolatos mutáció statisztikájához egy egyszerű Poisson-tesztet használtunk, hasonlóan a Samocha et al. 29. A trio fehérjében a de novo mutációk várható számát 4890 ASD-vel kapcsolatos rendellenességben szenvedő egyénnél a génspecifikus mutáció valószínűsége alapján számítottuk ki, amelyet Samocha és mtsai határoztak meg. A Trio-GEF1/DH1 doménben a de novo mutációk várható számát becsültük a Trio-ban várható mutációk számának átméretezésével, feltételezve, hogy a gén mentén az mutáció valószínűsége egyenlő. A genom egészére kiterjedő szignifikancia küszöbérték P-értéke −6 volt. Az eEPSC amplitúdó párosított elektrofiziológiai felvételeihez Wilcoxon Signed Rank tesztet alkalmaztunk a párosított adatokhoz. A Wilcoxon Rank Sum teszteket használtuk az elektrofiziológiai adatok összehasonlítására független körülmények között. A párosított pulzus-megkönnyítési méréseket és a gerincsűrűség-adatokat párosított és párosítatlan Student-féle t-teszttel elemeztük. Az összes elvégzett statisztikai teszt kétoldalas volt, és az összes teszt P-értéke