- Tárgyak
- Összegzés
- Bevezetés
- Eredmények
- A HuR kölcsönhatásba lép az XIAP IRES-szel
- A HuR közvetlenül kötődik az IRES XIAP RNS-hez
- A HuR sejtszintje modulálja az XIAP IRES aktivitását
- A HuR sejtszintje modulálja az endogén XIAP mRNS transzlációját
- A XIAP HuR által közvetített indukciója megvédi a sejteket az etopozid által kiváltott sejthaláltól
- Vita
- Kiegészítő információk
- Képfájlok
- 1. kiegészítő ábra
- Word dokumentumok
- Kiegészítő figura jelmagyarázat
Tárgyak
- Sejtpusztulás
- RNS-kötő fehérjék
- Fordítás
Összegzés
A sejtes kaszpáz XIAP belső inhibitorának expresszióját főleg a fehérjeszintézis szintjén szabályozzák. Az 5 'transzlálatlan régió belső riboszóma belépési hely (IRES) motívumot tartalmaz, amely sejtes stressz körülményei között támogatja az XIAP mRNS cap-független transzlációját. Ebben a tanulmányban megmutatjuk, hogy az RNS-kötő HuR fehérje, amelyről ismert, hogy anti-apoptotikus sejtprogramot szervez, stimulálja az XIAP mRNS transzlációját az IRES XIAP-en keresztül. Továbbá megmutatjuk, hogy a HuR in vitro és in vivo kötődik az XIAP IRES-hez, és stimulálja az XIAP mRNS poliszómákba történő toborzását. Fontos, hogy az apoptózist kiváltó etopozid ágens védelme a HuR túlzott expressziójával XIAP jelenlétét igényli, ami arra utal, hogy a HuR által közvetített citoprotekció részben megvalósul az XIAP fokozott transzlációján keresztül. Adataink arra utalnak, hogy az XIAP az anti-apoptotikus gének HuR által szabályozott RNS operonjához tartozik, amely a Bcl-2, Mcl-1 és ProTα-val együtt hozzájárul a sejtek túlélésének szabályozásához.
Bevezetés
Az apoptózis X-kapcsolt inhibitora (XIAP) az apoptózis fehérje család inhibitorának prototípus-tagja. A XIAP számos különféle funkciót lát el a sejten belül, beleértve a receptor által közvetített szignáltranszdukció modulálását, a fehérje ubiquitációját és elsősorban a kaszpáz közvetlen gátlását és ezáltal a sejtek túlélésének szabályozását (áttekintve Liston és mtsai., 2003; Dubrez-Daloz és mtsai. 2008) Bár nem írtak le olyan mutációkat, amelyek a XIAP-t társítják az onkogén transzformációhoz, a rák különböző típusaiban megemelkedett XIAP-szintről számoltak be, és a kemoterápiával és a sugárzással szembeni fokozott rezisztenciával társultak (Tamm és mtsai., 2000, 2004a, 2004b; Holcik és mtsai, 2000b; Yoon és mtsai, 2006; Gu és mtsai, 2009). Az XIAP expresszió célzásának terápiás potenciálját a közelmúltban számos klinikai vizsgálat bizonyította (Schimmer és mtsai, 2005, 2009; Dean és mtsai, 2007, 2009).
Az XIAP sejtszintjét több különböző mechanizmus szabályozza, de úgy tűnik, hogy az uralkodó szabályozás a transzláció iniciációjának szintjén van (Holcik, 2003). Az XIAP mRNS 5 'nem transzlált régiója (5' UTR) egy belső riboszóma belépési hely (IRES) motívumot hordoz magában, amely az XIAP mRNS hatékony transzlációját hajtja végre sejtes stressz körülményei között, amikor a globális transzláció a kupaktól függ (Holcik et al., 1999; Yoon és mtsai, 2006; Gu és mtsai, 2009). A sejtes mRNS-ek IRES-vezérelt transzlációja a közelmúltban a szelektív transzláció fontos szabályozójaként jelent meg, különösen hipoxia, endoplazmatikus stressz vagy szérum éhezés esetén (Holcik et al., 2000a; Holcik és Sonenberg, 2005). Ezek a körülmények gyakran jelen vannak a daganatokban, és sok rákos sejt túlélésükhöz specifikus mRNS-ek IRES által közvetített transzlációját igényli (Braunstein és mtsai, 2007; Silvera és mtsai, 2009). Noha azonosították a cap-függő transzláció IRES-re történő változását (Braunstein és mtsai, 2007), a sejtfehérjék pontos mechanizmusai és kohorszja, amelyek hozzájárulnak az IRES-függő transzláció szabályozásához, nem tisztázottak.
A XIAP IRES 162 nukleotid hosszúságú, és különálló RNS-szerkezetet alkot (Baird et al., 2007). Korábban jellemeztük az XIAP IRES szekvenciáját és szerkezeti jellemzőit (Holcik et al., 1999; Baird et al., 2007), és elkezdtük tisztázni az aktivitását szabályozó mechanizmust. Mi és mások azonosítottuk az IRES transzakciós faktorokat (ITAF), sejtes fehérjéket, amelyek specifikusan kötődnek és szabályozzák az IRES XIAP-t. Érdekes, hogy bár ezek közül a tényezők közül néhány stimulálja az XIAP IRES funkciót (Az autoantigén (Holcik és Korneluk, 2000); hnRNP C1/C2 (Holcik és mtsai, 2003); mdm2 (Gu és mtsai, 2009)), a többiek igen elnyomás (hnRNP A1 (Lewis és mtsai, 2007); PTB (Baird és mtsai, 2007)). Az IRES XIAP ribonukleoprotein komplex (RNP) jellege és az összes ITAF XIAP identitása azonban továbbra sem ismert.
Ebben a munkában IRES XIAP RNS-RNS affinitáskromatográfiát alkalmaztunk a HuR új XIAP ITAF azonosítására. Megállapítottuk, hogy a HuR in vitro kötődik az XIAP IRES-hez, és in vivo egy XIAP-IRES-RNP komplex része. Ezenkívül a HuR stimulálja az endogén XIAP mRNS transzlációját, amely hozzájárul a sejt életképességének megőrzéséhez az etopozid által közvetített sejthalál modelljén.
Eredmények
A HuR kölcsönhatásba lép az XIAP IRES-szel
Teljes méretű kép
Ezután felmérjük, hogy az endogén HuR asszociál-e az endogén XIAP mRNS-sel a sejtekben. Immunprecipitáltuk az RNS-fehérje komplexeket HuR, IgG (negatív kontroll) vagy TIA-1/TIAR (ismert RNS-kötő fehérje) antitestek felhasználásával fehérjekivonatokból olyan körülmények között, amelyek megőrizték az RNS-fehérje komplexeket, a fentiek szerint (Lewis et al., 2007). RNS-t izoláltunk ezekből az immunprecipitátumokból, és reverz transzkripcióval állítottunk elő komplementer DNS-t (cDNS), majd PCR-amplifikációt végeztünk XIAP-t és β-aktint kódoló szekvencia-specifikus primerekkel. Nem tudtunk amplifikálni jelentős mennyiségű XIAP-t egy IgG vagy TIA-1/TIAR immunrecipitációból (1c. Ábra, 3. és 4. sáv). Azonban a HuR elleni antitestekkel végzett immunprecipitáció együtt kicsapta a XIAP mRNS-t (1c. Ábra, 2. sáv), megerősítve, hogy az endogén HuR asszociálódik az endogén XIAP mRNS-rel a sejtekben in vivo. Nem tudtuk amplifikálni immunprecipitátumunk nagy mennyiségű β-aktin transzkriptumát egyik antitesttel sem, ami azt jelzi, hogy XIAP mRNS koimmunoprecipitációnk specifikus. Bár a HuR-ról beszámoltak a β-aktin transzkripcióval kapcsolatban (Dormoy-Raclet és mtsai, 2007), ezt az összefüggést nem tudtuk megerősíteni.
A HuR közvetlenül kötődik az IRES XIAP RNS-hez
A HuR három RNS-felismerési motívumot (RRM) tartalmaz, amelyek közül az RRM1 és az RRM2 részt vesz az RNS-kötésben, míg az RRM3 szükséges a HuR-oligomerek RNS-be történő kooperatív összeillesztéséhez, de minimálisan hozzájárul az RNS-kötődéshez (Fialcowitz-White et al., 2007). HuR deléciós mutánsokkal végzett UV térhálósító kísérletekkel (Mazroui et al., 2008) teszteltük, hogy ez érvényes-e a HuR IRES XIAP-hez való kötődésére is. A tisztított AP-HuR-GST-t (teljes hosszúságú HuR), AP-HuR (CP1) -GST (RRM1 és RRM2 tartalommal) vagy AP-HuR (CP2) -GST (RRM3 tartalommal) inkubáltuk [32 P] -vel jelölt XIAP-vel. RNS IRES, majd UV térhálósítás és SDS-PAGE elválasztás. Megállapítottuk, hogy RRM1 és RRM2 szükséges a HuR XIAP IRES-hez való kötődéséhez (1A. Kiegészítő ábra), ami azt jelzi, hogy a HuIA XIAP IRES RNS-hez való kötődésének mechanizmusa hasonló a többi HuR cél RNS-hez. Ezenkívül teszteltük ezen deléciós konstrukciók azon képességét, hogy modulálják az XIAP IRES aktivitást (lásd alább).
A HuR sejtszintje modulálja az XIAP IRES aktivitását
50% XIAP IRES aktivitásban egy nem csendes kontrollhoz képest (2b. Ábra). Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy a HuR rendelkezik ITAF stimuláló aktivitással az IRIS XIAP szempontjából. Megfigyeléseink alternatív magyarázata az lehet, hogy a HuR befolyásolja a bicistronic riporter RNS transzkriptum integritását, megváltoztatva ezzel a CAT és a β-gal fehérje arányát. Ezért meghatároztuk a HuR-szintek modulációjának hatását a bicistronic β-gal/(- 162)/CAT RNS transzkripciós integritására kvantitatív reverz transzkriptáz-PCR alkalmazásával, a korábban leírtak szerint (Holcik et al., 2005). A transzfektált sejtekből teljes RNS-t izoláltunk, és reverz transzkripcióval komplementer DNS-t állítottunk elő. A kvantitatív PCR-t olyan primerek alkalmazásával hajtottuk végre, amelyek amplifikálták a β-gal kódoló régió egy részét és a CAT kódoló régió egy részét. Amint a 2c. Ábra mutatja, a CAT és a β-gal cistronok aránya nem változott a sejtekben, függetlenül a HuR expresszió állapotától.
Teljes méretű kép
A HuR sejtszintje modulálja az endogén XIAP mRNS transzlációját
Megmutattuk, hogy a HuR megköti és pozitívan szabályozza az XIAP IRES aktivitását. Ezután megvizsgáljuk, hogy a HuR sejtszintje befolyásolja-e az endogén XIAP mRNS transzlációját. A HEK293T sejteket átmenetileg transzfektáltuk egy GFP-t vagy GFP-HuR-t expresszáló plazmiddal, és az endogén XIAP-szinteket Western blot-analízissel határoztuk meg 24 órával a transzfekció után. Megállapítottuk, hogy a GFP-HuR túlexpresszió az XIAP fehérje szintjének ~ 2-szeres növekedését okozta a GFP kontrollhoz képest (3a. Ábra), az XIAP mRNS szintjének egyidejű növekedése nélkül (3b. Ábra). Egy fordított kísérletben a HEK293T sejteket kontroll siRNS célzással vagy HuR csendesítés nélkül transzfektáltuk, és az XIAP fehérje szintjét 48 órával később Western blot elemzéssel határoztuk meg. Megállapítottuk, hogy a HuR szintjének siRNS általi csökkentése a
50% az XIAP fehérje szintekben egy elnémítás nélküli kontrollhoz képest (3c. Ábra), míg az XIAP mRNS szintjére nem volt hatással (3b. Ábra). Ezek a megfigyelések párhuzamosan látták az XIAP IRES riporter felépítését (2. ábra), ami arra utal, hogy a HuR az XIAP IRES függvény modulálásával az XIAP transzláció pozitív szabályozója.
Teljes méretű kép
Annak további bizonyítására, hogy a HuR valóban befolyásolja az endogén XIAP mRNS transzlációját, poliszomális profilalkotással vizsgáltuk az XIAP mRNS és a riboszóma transzláció összefüggését HuR-t túlzott mértékben expresszáló sejtekben. Megfigyeltük, hogy a HuR túlexpresszió a nehéz poliszómák enyhe veszteségét és a monoszómák növekedését eredményezte (3d. Ábra), ami a globális fehérjeszintézis visszaszorítását jelzi. Ez a megfigyelés meglehetősen meglepő volt, mivel a HuR nem ismert, hogy befolyásolja a fehérjeszintézis teljes sebességét. Az egyes frakciókból származó XIAP mRNS reverz transzkriptáz-PCR amplifikációja azonban azt mutatta, hogy a teljes fehérjeszintézis csökkenése ellenére az XIAP mRNS a sejtek nehezebb poliszómáiba kerül beszervezésre.
A XIAP HuR által közvetített indukciója megvédi a sejteket az etopozid által kiváltott sejthaláltól
A HuR túlzott expresszió XIAP-függő módon védi a sejteket az etopozidok által kiváltott sejthalál ellen. A HEK293T sejteket reverz transzfektáltuk nem csendesítő kontrollal (CTRL) vagy siRNS-sel, amely XIAP-t célzott meg, majd 24 órával később egy GFP-t vagy GFP-HuR-t expresszáló plazmiddal. A transzfekció után 24 órával a sejteket 24 órán át etopozid jelzett dózisával kezeltük, és a sejtek életképességét Alamar kék vizsgálattal határoztuk meg. Három példányban elvégzett két független kísérlet átlaga ± sem (bar) (* P