ezek

Bevezetés

Egy viszonylag egyszerű sejt, például az Escherichia coli baktérium, több mint 4000 különböző fehérjét képes előállítani. A víz után a fehérjék a leggyakoribb molekulák a sejtekben (

Baktérium tömegének 15% -a). A sejt több ezer, állandó mozgásban levő és meghatározott struktúrákba szerveződött molekula. Ez a gyűjtemény fehérjéket, nukleinsavakat, poliszacharidokat, lipideket, metabolitokat és kis ionokat tartalmaz, mint például nátrium, kálium és magnézium. A következő videón látható egy animáció, amely bemutatja a cellán belül folyamatosan előforduló folyamatok sokféleségét:

Az enzimek a sejtben rendkívül sokféle funkcióval rendelkeznek: lebontják a cukrokat, szintetizálják a zsírokat és aminosavakat, hűen másolják a genetikai információkat, részt vesznek a kívülről érkező jelek felismerésében és továbbításában, és felelősek a sejt mérgező melléktermékeinek lebontásáért, sok más létfontosságú funkció mellett. Az élőlény azonosságát és fiziológiai állapotát az enzimek összegyűjtése határozza meg, amelyek sebészi pontossággal és a sejtek bármely pillanatában villámsebességgel működnek. Így az evolúció milliói alatt a természet az enzimek sokféleségét fejlesztette ki az élet összetett jelenségének fenntartása érdekében.

Mennyire hatékonyak az enzimek? Hogyan működnek?

Az enzim hatékonyságának mérésére többféle módon van lehetőség. A legegyszerűbb annak meghatározása, hogy a reakció milyen gyorsan megy végbe, tekintve, hogy hány szubsztrátmolekula alakul át másodpercenként, mint a szénsav-anhidráz példában. Ha összehasonlítjuk, hogy a katalizált reakció milyen gyorsan halad az enzim hiányában, értékelhetjük az enzimek, mint reakciógyorsító hatékonyságát. Egy másik módszer az, hogy mérlegeljük a reakció kialakulásához szükséges időt. Az eddigi leghatékonyabb enzim az oritidin-5'-foszfát (OMP) nevű szubsztrát dekarboxilezését katalizálja, OMP-dekarboxiláznak hívják. A katalizálatlan reakció 78 millió évig tart. Szerencsére az OMP dekarboxiláz enzim 10-17-szer gyorsítja fel a reakciót, tehát alig 25 ezredmásodperc alatt fordul elő. Ez a reakció nagyon fontos, mivel az uridin-monofoszfát nukleotid termelési láncának része, amely a ribonukleinsav (RNS, angol rövidítése) 4 komponensének egyike.

Hogyan végzik az enzimek ezt a munkát? Ne feledje, hogy az enzimek olyan fehérjék, aminosavak polimerjei, amelyek meghatározott háromdimenziós szerkezettel rendelkeznek. Aktivitása, amely magában foglalja a szubsztráttal való interakciót, háromdimenziós szerkezetétől függ. Ha ez módosul, a katalitikus kapacitás csökkenhet. Annak érdekében, hogy jobban megértsük, hogyan hajlik vagy hajlik egy fehérje a térben, számítási eszközöket fejlesztettek ki ennek a jelenségnek a szimulálására. A kis fehérje hajtogatásának szimulációja a következő videóban látható:

Most mi irányítja vagy határozza meg a fehérje hajtogatását? A fehérjék elegánsan hajtogatnak az őket alkotó aminosavak szekvenciájától függően (aminosavmaradékoknak nevezik őket, mivel ezek egy fehérje részei), és a redők és görbék között bizonyos üregeket vagy helyeket képeznek affinitással a különböző molekulákhoz. Az enzimek esetében ezeken a helyeken következik be a kémiai reakció. Itt van egy nagyon jól sikerült videó, amely a fehérjék és a kis molekulák közötti kölcsönhatás szimulációját mutatja be:

Valahányszor a tudósok egy csoportja meghatározza egy fehérje háromdimenziós szerkezetét, azt egy "Protein Data Bank" (PDB) nevű weboldalon helyezik el. Erről az oldalról kiválasztottuk az enzimek galériáját, amelyet a következő ábra mutat be, kiemelve néhány napjainkban ismert redő kifinomultságát és szépségét (1. ábra). Mindezek a fehérjékről alkotott csodálatos nézetek a strukturális biológia fejlődésének köszönhetők, amely viszonylag fiatal tudomány, amint azt a következő szakaszban megemlítjük.

1.ábra. Enzim Galéria. A szénhidrogén-anhidráz fenntartja vérünk pH-ját (PDB 1CA2). A luciferázt egy medúza izolálták, és felelős a szentjánosbogarak biolumineszcenciájáért is (PDB 2D1S). Az alkohol-dehidrogenáz lebontja az alkoholt, amelyet iszunk, a májban termelődik (PDB 1AGN). A triozefoszfát-izomeráz fontos a cukrok metabolizmusában (PDB 2YPI). A citokróm P450 módosítja a szervezetünkbe kerülő gyógyszereket és mérgező vegyületeket (PDB 1W0E). Beszerezve az EKT-ból (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do).

A reakciót felgyorsító enzimatikus mechanizmusok nagyon változatosak. A két legegyszerűbb és leg intuitívabb a "megközelítés" és a "tájékozódás". Mint minden kémiai reakcióban, a reagenseknek is elegendő energiával és megfelelő irányban kell ütközniük egymással, hogy a molekulák közötti kötések megszakadjanak vagy kialakuljanak. Mivel ezek az ütközések teljesen véletlenszerűen fordulnak elő, nem mindegyikük produktív, vagyis nem mindegyik vált ki kémiai reakciót. Mint korábban említettük, az enzimeknek vannak üregei, amelyek befogadják a szubsztrátumokat, hogy egymással reagáljanak. Ezek alkotják az enzim "aktív helyét". Ezen a helyen olyan specifikus aminosavmaradékok találhatók, amelyek lehetővé teszik a szubsztrátokkal való kölcsönhatást, és megkönnyítik az új kötések megtörését és kialakulását.

Egyes enzimek szerkezetében fémek vannak (például vas-, réz- és cink-ionok), amelyek részt vehetnek a katalitikus folyamatban.

Egyes enzimek szerkezetében fémek vannak (például vas, réz és cink ionok), amelyek részt vehetnek a katalitikus folyamatban. Emiatt elengedhetetlen az enzim háromdimenziós szerkezetének fenntartása, mivel az aminosavmaradékok és más kofaktorok (azaz fémek) helyzete és orientációja határozza meg, hogy a reakció megtörténik-e vagy sem. A szubsztrátok az enzim aktív helyével kölcsönhatásban közelebb vannak egymáshoz (megközelítési mechanizmus), és szintén sajátos módon orientálódnak (orientációs mechanizmus). Mintha a szubsztrátoknak lenne sablonjuk vagy templátjuk (vagyis az enzim aktív helye), ahol véletlenszerű ütközésekre támaszkodva „fészkelődhetnek”, hogy találkozzanak és reagáljanak. Ily módon az enzim jelenléte egy másik módot biztosít egy bizonyos kémiai reakció lefolytatására. Ez a mechanizmus általában kevesebb energiát igényel, ezért a kémiai reakció gyorsabban megy végbe az enzim jelenlétében. Egy nagyon szemléletes videó, amely példázza ezt a folyamatot, itt látható:

Az enzimek másik nagyon fontos jellemzője a specifitásuk, vagyis az, hogy más molekulák jelenlétében mennyire képesek felismerni egy szubsztrátot - és csak azt a szubsztrátot. Ez a több száz különböző molekula megkülönböztetésének képessége egy másik oka annak, hogy az enzimek háromdimenziós szerkezete kulcsfontosságú funkcionalitásuk szempontjából. Ha az aktív hely szerkezete túl rugalmas és dinamikus lenne, akkor a szubsztrát iránti affinitás nagyon alacsony lenne, és a reakció nem haladna olyan gyorsan. Ebben az értelemben a fehérjetechnika egyik kihívása a fehérje hajtogatásának megértése, annak ismerete érdekében, hogy miként lehet manipulálni a szerkezet stabilitását és javítani. Mivel az enzimek az evolúció által tervezett fehérjék, amelyek a sejteken belül nagyon korlátozott körülmények között működnek (azaz 30-37 ° C, légköri nyomás vagy vizes közeg), amikor más reakciókörülmények között (magas hőmérsékleten, szerves oldószerekkel vagy mechanikus keveréssel) általában elveszítik szerkezetüket és ezért tevékenységüket.

Hogyan fedezték fel az enzimeket?

Az enzimatikus eljárás első szabadalma ettől az időponttól származik: Takamine 1894-ben szabadalmaztatta az általa „diasztáznak” nevezett enzimet, amelyet egy gomba állított elő, és amely ma is a piacon van.

Az enzimek molekuláris szintű tanulmányozásának története meglehetősen friss. Hansen idejében a tudósok már megérezték, hogy a sejtekben van "valami", amely fontos szerepet játszik az ott végbemenõ kémiai átalakulásokban. A tudósok ezeket az anyagokat "fermenteknek" nevezték. Még Berzelius svéd vegyész javasolta 1835-ben, hogy az erjesztőknek katalitikus szerepük van. Úgy gondolták azonban, hogy ezek csak az élő sejtek jelenléte miatt működnek, ami olyan "életerőt" ad nekik, amely aktívvá teszi őket. Csak 1897-ben sikerült bebizonyítani, hogy a sejtek fermentálódnak vagy kivonatok, élő sejtek hiányában, katalizálják a reakciókat. Ezt a felfedezést Eduard Buchner német tudósnak köszönhetjük, akit 1907-ben kémiai Nobel-díjjal tüntettek ki, mert bebizonyította, hogy a sejtmentes élesztő kivonatok katalizálhatják az alkoholos erjedést, vagyis a cukrok alkohollá való átalakulását. Buchner azt javasolta, hogy az erjesztőknek fehérjében legyenek 1 .

1926-ban James B. Sumner amerikai tudós először tisztított és kristályosított egy enzimet, az ureázt, megmutatva, hogy ez fehérje, és tesztelve Buchner ötletét. Megállapításaiért Sumner megkapta az 1946-os kémiai Nobel-díjat John H. Northrop és W.M. Stanley, szintén amerikai tudósok, akik 1930-ban további 2 enzimet tisztítottak. Később, a strukturális biológia kezdetéhez adva, David Chilton Phillips tudós 1965-ben határozta meg először a lizozim enzim háromdimenziós szerkezetét, az enzim kristályának röntgendiffrakciós mintázatának felhasználásával. Ez óriási előrelépést jelentett, mivel ezzel a technikával részletesen megismerhető az enzimek molekulaszerkezete, és ennek alapján hipotézisek generálódhatnak működésükről, változások tervezhetők meg egyes szermaradványokban tulajdonságaik (katalitikus hatékonyság, specifitás vagy stabilitás, többek között), vagy szimulálja mozgásukat és kölcsönhatásukat más molekulákkal.

Ez minden bizonnyal izgalmas időszak volt, mind tudományos, mind technológiai szempontból. 1913-ban megjelent Michaelis és Menten ma már klasszikusnak számító cikke, amelyben modellt javasolnak az enzimek kinetikus viselkedésének magyarázatára. Ez a matematikailag nagyon egyszerű modell leírja, hogyan növekszik egy enzimatikusan katalizált reakció sebessége a szubsztrát koncentrációjának növekedésével. A sebesség megközelíti a maximumot, amelyben feltételezzük, hogy az aktív helyek telítettek, és ezért a reakció nem haladhat nagyobb sebességgel. A cikk éppen kommentált változatával, amely most töltötte be a századik életévét, a következő címen lehet tájékozódni: http://academics.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/initialvelocity.html. Érdemes megemlíteni, hogy az enzimek túlnyomó többségének kinetikus viselkedése közel áll ehhez a modellhez, vagy ennek vannak változatai. Valójában ez az alapmodell, amelyet manapság az egész világon folyó enzimológiai tanfolyamokon tanítanak. Tehát, mint látható, a múlt század elején az asztal már fel volt készítve az enzimek működésének teljes megértésére.

1 Ha többet szeretne megtudni erről a tudósról, keresse fel a Nobel-díj oldalát (http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1907/)

Hogyan használhatók az enzimek?

Mindezek a technológiai alkalmazások nem valósulhatnak meg az enzimek nagyszabású, olcsó előállítása nélkül. A géntechnika ebben a tekintetben elengedhetetlen volt. Ennek az eszköznek köszönhetően lehetőség van egy szervezetből kinyerni azt a gént (amely dezoxiribonukleinsavból áll, az angol rövidítés angolul DNS), amely egy adott enzimet kódol, és be tudja vezetni egy másik szervezet genetikai anyagába.

A géntechnika ebben a tekintetben elengedhetetlen volt. Ennek az eszköznek köszönhetően lehetőség van egy szervezetből kinyerni azt a gént (amelyet a dezoxiribonukleinsav, az angol rövidítéssel magyarul DNS alkot), amely egy adott enzimet kódol, és be tudja vezetni egy másik organizmus genetikai anyagába.

Ezt a lenyűgöző felfedezést, amely megalapozta a modern biotechnológia tudományos alapjait, 1973-ban a kutatók egy csoportja a Kaliforniai Egyetemen, San Franciscóban végezte (COHEN et al., 1973). Általában a DNS-t olyan mikroorganizmusba vezetik be, amely gyorsan növekszik és nagy mennyiségben termeli a kívánt fehérjét. Az ezzel a technikával előállított terméket rekombináns fehérjének nevezzük. A baktériumok ideális jelöltek erre a feladatra. Ezek exponenciálisan szaporodnak, könnyen genetikailag manipulálhatók, és a növekedéshez olcsó tápanyagok szükségesek. Például a citokróm P450 enzimek olyan enzimek, amelyek aktív helyükön vasat tartalmaznak, és képesek sokféle szerves vegyület oxidációját katalizálni oxigénként oxidálószerként. Az embernek sok citokrómája van, amelyek segítenek a testünkbe jutó mérgező vegyületek lebontásában. Ha ezeket a molekulákat szeretnénk alaposan tanulmányozni, nagyon nehéz és drága lenne ezeket közvetlenül a testünkből beszerezni. Éppen ezért a géntechnológiai technikák lehetővé tették nagy mennyiségű emberi citokróm előállítását Escherichia coliban.

Ezen népszerű baktérium mellett számos élőlényből lehet fehérjét expresszálni vagy termelni gombában, például Saccharomyces cerevisiae élesztőben vagy akár rovarsejtekben. Míg a 20. század közepén (kb. 1960) a kereskedelmi enzimek mintegy 70% -a növényekből és állati szervekből származik, ma 90% -a mikroorganizmusokból származik, és az ipari felhasználásra szánt enzimek többségét (több mint 50%) rekombinánsan állítják elő (ILLANES, 2010).

A rekombináns technológiával előállított fehérje egyik első esete az inzulin, egy fehérje hormon, amelyet a cukorbetegség kezelésére használnak.

Következtetés

Bibliográfia

COHEN SN, Chang ACY, Boyer HW és Helling RB. "Biológiailag funkcionális bakteriális plazmidok építése in vitro", National Academy of Science USA, 1973, 70, 3240–3244.

----- Andrés Illanes (szerkesztő). Enzim biokatalízis: alapelvek és alkalmazások. Springer, 2010.

GOEDDEL és mtsai. "Kémiailag szintetizált emberi gén inzulin expressziója Escherichia coliban". Proceedings of the National Academy of Science USA, 1979, 76, 106–110.

JOHNSON KA & Goody RS. "Az eredeti Michaelis-állandó: az 1913-as Michaelis-Menten lap fordítása". Biochemistry, 2011, 50, 8264-8269.