Összegzés

Antitest, lizin eredetű ciklopropén beépítése lehetővé teszi a tetrazint tartalmazó molekulák specifikus, gyors és hatékony megkötését konjugált antitest gyógyszerek előállításához.

Absztrakt

Bevezetés

Az antitest-gyógyszer konjugátumok (ADC) kombinálják a bioterápiás szerek szelektivitását és a kis citotoxikus molekulák hatékonyságát. A legtöbb ADC azt állítja, hogy csökkenti a hagyományos kemoterápia mellékhatásait olyan gyógyszerek célzásával, amelyek befolyásolják a rákos sejtekben a DNS vagy mikrotubulusok polimerizációját 1. Az Food and Drug Administration (FDA) által jóváhagyott első generációs ADC-k a lizinek és a ciszteinek módosításán alapulnak, amely módosított molekulák keverékeit állítja elő különböző pozíciókban, csökkent farmakokinetikai tulajdonságokkal 2. Éppen ellenkezőleg, a gyógyszerek antitestekkel történő specifikus konjugálása jobb, 3, 4 terápiás indexű vegyületeket eredményezhet. A homogén ADC-k előállításának kihívásával próbálkozva számos szelektív kémiai és enzimatikus módosítást jelentettek 1, 5. A jelenlegi módszerek azonban csak egy bizonyos pozíciót célozhatnak meg az antitesten, alacsony fehérje-expresszióval küzdenek, alacsony stabilitású kapcsolókat biztosíthatnak, vagy lassú reakciókra és alacsony hozamra támaszkodhatnak.

A nem kanonikus aminosavak (ncAA) beépítése a genetikai kód kiterjesztésével lehetővé teszi a reaktív bioortogonális csoportok rengeteg helyspecifikus telepítését a fehérjékben, potenciálisan túllépve az ADC-k előállításához használt egyéb módszerek korlátait. A cél (stop) kodonra adott válaszként az ncAA-k kódolása aminoacil-tRNS-szintetáz/tRNS-párokon alapul, amelyek ortogonálisak az endogén párokra, amelyek 6 kánonikus aminosavat tartalmaznak. Számos NcAA-t beépítettek az antitestekbe az ADC-k előállításához. A terápiás gyógyszerek konjugálásával kapcsolatos alkalmazások esetében azonban különféle felelősségek szenvednek jobban. A p-acetil-fenilalanin (pAcF) 7, 8 nem teljesen bioortogonális, alacsony pH-értéket (4,5) és hosszú reakcióidőt (> 60 óra) igényel, míg az azidok, például p-azidofenilalanin (pAzF) 7, 9, 10, p- azidometil-fenil-alanin (megfordítás) 11 és a lizin-azid (AzK) 12, 13 származékai redukálódhatnak a 14. sejtben, a Huisgen aktivitásának katalizálására használt réz pedig oxidatív károsodást idézhet elő 15 .

Noha transzport alapú alternatív ncAAs-ciklo-oktént (TCO), ciklooktint (SCO) és biciklo [6.1.0] nonént (BCN) nemrégiben egy antitestben kódoltak bioképalkotás céljából, az expressziós rendszer nagyon alacsony hozammal jár (0,5 mg/l) 16. Másrészt a ciklooktenek és a ciklooktinek nagy és hidrofób fogantyúk, amelyek növelhetik az ADC hajlamát a hasznos teherekre - az aggregációs ADC-k hagyományosan hidrofóbak, a kolbászgép fizikai-kémiai tulajdonságai pedig magas farmakokinetikai és terápiás hatásindexet mutatnak Ezzel szemben az 1,3-diszubsztituált ciklopropének kicsi reaktív csoportok, amelyek minimális változásokat okozhatnak a fehérje szerkezetében és a fizikai-kémiai tulajdonságokban 18. A ciklopropének szelektíven és gyorsan reagálnak a tetrazinokkal egy inverz elektronikus igényű Diels-Alder ciklusterdíción keresztül 19. Ebben a protokollban lizintartalmú származékot használunk (CypK, 1b. Ábra)) egy metil-ciklopropén, amelyet a szterikus akadályok kevésbé érintenek, mint a nagyobb szűrt telítetlen gyűrűk, és reakciósebessége 1-30 M -1 s -1 nagyságrendű vizes közegben 18, 20 .

Nemrégiben arról tájékoztatott minket, hogyan lehet beépíteni a CypK-t az antitestekbe az ADC-k előállításához, ha ezt a bioortogonális minimális tengelyt tetrazintartalmú molekulákkal reagáltatjuk 21. Itt részletesebben leírjuk az ADC előkészítési eljárását, külön hangsúlyt fektetve a nehezebb lépésekre. A CypK beépülését egy pirrolizil-tRNS-szintetáz (PylRS)/tRNACUA (PylT) párral célozzuk meg az antitest nehézláncába (HC) 22 bejuttatott borostyánsárga kodonra válaszul. Itt két plazmidot használunk a tranziens transzfekcióhoz (1a. Ábra)), amely az antitest nehéz láncát kódolja, a másik pedig a könnyű láncot (LC) kódolja, mindkettő tartalmazza a PylRS/PylT kazettát. Alternatív megoldásként egy stabil sejtvonal, amely nagyobb antitesthozamokat tesz lehetővé, fáradságosabb eljárással állítható elő. .

A fenti expressziós rendszerek képesek a vad típusú antitestekhez hasonló szinten CypK-val terápiás anti-HER2 immunglobulin 1 (IgG1) trasztuzumabot előállítani. Kiválasztottuk a nehéz lánc CH1 doménjének első helyzetét az ncAA kódolására (HC-118TAG). Ez az ADC-k 23 leggyakrabban módosított helye, és HC-118 (EU felsorolás) néven ismert, de HC-121 (szekvencia helyzet) és HC-114 (Kabat felsorolás) 24 néven is ismert. Mivel ez a helyzet az IgG1-ekben megőrződött, ezeknek az expressziós rendszereknek érzékenyeknek kell lenniük a legterápiásabb antitestekre.

Bemutatjuk, hogy a trasztuzumab (CypK) 2 könnyen tisztítható az A fehérjéből, majd hidrofób interakciós oszloppal (HIC-FPLC) gyors fehérjetartalmú folyadékkromatográfia következik. Ezt követően az antitest 3 órán belül kovalens a mikrotubulus polimerizációs inhibitor monometil auristatin E (MMAE) iránt, amelyet az FDA által jóváhagyott Adcetris ADC-ben használnak. Itt benzilszármazék-tetrazin MMAE-t (tetrazin-vcMMAE) használunk egy linkerrel, amely egy glutarát távtartót és egy valin-citrullin proteáz labilis komponenst tartalmaz, amelyet egy önimmunatív p-amino-benzil-alkohol-egység követ; Ezt a linkert a katepszin B hasítja a lizoszómában az ADC internalizálásakor, ami a 25 toxin felszabadulását eredményezi nyom nélkül. A reakció szélességének igazolására, hogy az antitest a fluorofór-tetrametil-rodaminhoz (TAMRA) is kötődik. Megmagyarázzuk, hogyan lehet ellenőrizni a konjugátum azonosságát folyadékkromatográfiával, tömegspektrometriával (LC-MS) összekapcsolva, és kiszámítani a gyógyszer-antitest arányt (DAR) nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával hidrofób kölcsönhatás oszlopon (HIC-HPLC). .

Az antitestteljesítmény jellemzésének részeként leírjuk, hogyan lehet ellenőrizni a dihidropiridazin ízületi stabilitását az emberi szérumban. Ez a paraméter könnyebben értékelhető a trastuzumab-TAMRA-ban, mert egyszerű ELISA-val számszerűsíthető és az eredmények értelmezését nem bonyolítja a trastuzumab-proteáz (MMAE) labilis komponense 2. Végül a trastuzumab (MMAE) 2 szelektivitását és hatékonyságát úgy értékeljük, hogy összehasonlítjuk az ADC citoxicitását a HER2 különböző szintjét expresszáló sejtvonalakon. Ez a vizsgálat az ADC stabilitásának funkcionális tesztjét is biztosítja, amikor az immunkonjugátumot humán szérumban végzett inkubálás után hajtják végre.

Jegyzőkönyv

1. állítsa elő és jellemezze az antitestet

4. értékelje az ADC citotoxicitását

Megjegyzés: Ez a protokoll a korábban bejelentett 23., 26. kísérleten alapul, bizonyos módosításokkal.

Reprezentatív eredmények

A bemutatott tranziens expressziós rendszer (1a) literenként 22 ± 2 mg trasztuzumab (CypK) 2-t termel, ami az azonos körülmények között termelt vad típusú antitest 2/3-át képviseli (1C. ábra).). A stabil sejtvonal ezt a hozamot 2 mg/L ± 31 21-ig növelheti .

A trastuzumab (CypK) 2 konjugálható tetrazin-vcMMAE-vel, amely 25 ° C-on 2-3 órán keresztül szinte homogén trasztuzumabot (MMAE) eredményez (2. ábra).). Ennek a citotoxinnak a nagy hidrofobitása 10% acetonitril hozzáadását igényli, ha a toxin CypK-nként 5 vagy több moláris ekvivalensét használjuk. Másrészről a ciklusaddíció 20 órán belül befejeződik 2 ekvivalens tetrazin-vcMMAE-vel acetonitril nélkül (2C. Ábra).). A trastuzumab (CypK) 2 2 órán belül reagál a tetrazin-TAMRA-val 25 ° C-on, és 3-6 óra szükséges, ha a hőmérsékletet 4 ° C-ra csökkentik (3C. Ábra)).

A trastuzumab (MMAE) 2 HPLC-HIC segítségével mért várható DAR értéke 1,9 (2b. Ábra)). A kromatogramon eredetileg 8,0 percnél megfigyelt csúcs a konjugálatlan antitestet (DAR 0) képviseli, és a reakció befejeződésével teljesen eltűnt. A DAR 1 fajok 9,1 9,6 percig eluálódnak, és 90% -os területtel kell rendelkezniük. A mobilitás és a fluoreszcencia fordulata az SDS-PAGE gélekben megerősíti a TAMRA beépülését (3b. Ábra) és az immunkonjugátumok azonosságát LC-MS-mel ellenőrizzük (2d. ábra)-és y 3d ábra).

A trastuzumab (TAMRA) 2 inkubálása 5 napig humán szérumban és az ezt követő ELISA-analízis megerősíti, hogy a terhelés továbbra is az antitesthez kötött (4b. Ábra)). A citotoxicitási vizsgálaton a trastuzumab (MMAE) 2 nagy hatékonyságot mutat az SK-BR-3 emlő (magas HER2) rákos sejtekben, az átlagos maximális effektív koncentráció (EC50) 55 ± 22:00 (4. ábra d). A trastuzumab (MMAE) 2 5 napos humán szérumban történő inkubálás után fenntartja a citotoxicitást (4. c ábra). Ezzel szemben, ha az ADC-t MCF-7-ben (alacsony HER2) elemzik, az EC50 200-szor alacsonyabb (4. ábra d). A vad típusú antitest, a trastuzumab (CypK) 2 és a tetrazin-vcMMAE rendkívül alacsony toxicitást mutat (4e és 4 ábra d), míg az MMAE mindkét nemi szelektív citotoxicitást mutat mindkét sejtvonalban (4e. ábra)).

konjugátumok

1. ábra: tranziens expressziós rendszer. NAK NEK. a HEK293 sejtekben a tranziens transzfekcióhoz használt plazmidok régiói. CMV: citomegalovírus promoter, WPRE: a marmot hepatitis vírus poszttranszkripciós szabályozó eleme, PylT: pirrolizil tRNS, U6: specifikus promoter, PylRS: pirrolizil tRNS szintetáz,> és ε - [((2-metilcikloprop-2-en- 1 -il) metoxi) karbonil] -L-lizin (CypK). C. A vad típusú trasztuzumab (WT) és a trasztuzumab (CypK) 2 expressziós hozama Western blot-ban mérve a fehérjetisztítás után. A hibasávok a biológiai triplikátok szórását jelentik. Ezt az ábrát Oller-Salvia és mtsai engedélyével módosították. 2018 21. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


2. ábra: A trastuzumab (CypK) 2 konjugálása tetrazin-vcMMAE-vel. NAK NEK. Az elektronikus fordított eljárás Diels-Alder ciklusterdíciót igényel az antitestben lévő CypK-maradék és az MMAE tetrazin-származéka között. A reakciócsoportok piros színnel vannak kiemelve, a p-amino-benzil-alkohol zöld színnel, a valin-citrullin-dipeptid kék színnel van jelölve. B. Az antitest konjugáció előrehaladását bemutató HPLC-HIC kromatogramok. C. konverzió mértéke a maximális 1,9 DAR-hoz képest, különböző reagenskoncentrációk mellett. NAK,-NEK. A teljes hosszúságú antitestek dekonvolút tömegspektruma a konjugáció előtt és után. Trastuzumab (CypK) 2-t kaptunk a stabil sejtvonal alkalmazásával. Ezt az ábrát Oller-Salvia és mtsai engedélyével módosították. 2018 21. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


3. ábra: A trastuzumab (CypK) 2 konjugálása tetrazin-TAMRA-val. NAK NEK. Az elektronikus fordított fordulatszám Diels-Alder cikloaddíciót igényel az antitestben lévő CypK-maradék és a TAMRA tetrazin-származéka között. B. A TAMRA konjugációból származó SDS-PAGE gélek mobilitási változást és gél fluoreszcenciát mutatnak. C. verbális kinetika két különböző hőmérsékleten. D. A trasztuzumab dekonvolút tömegspektruma (TAMRA) 2. A trastuzumab (CypK) 2-t stabil sejtvonal alkalmazásával kaptuk. Ezt az ábrát Oller-Salvia és mtsai engedélyével módosították. 2018 21. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


4. ábra: A trasztuzumab-konjugátumok szérumstabilitása és citotoxicitása. NAK NEK. rajzok, amelyek kiemelik a kívánt jellemzőket egy internalizáló ADC-ben. B. a trastuzumab (TAMRA) 2 stabilitása az emberi szérumban, ELISA-val mérve. C. sejt életképességi vizsgálat trasztuzumabbal (MMAE) 2 5 nap után humán szérumban (+ szérum, fekete). Egy kontrollmintát PBS-ben inkubáltunk, szérum helyett (szérum, piros). D. sejt életképességi vizsgálat frissen hígított antitestmintákkal. ÉS. sejt életképességi vizsgálat frissen hígított MMAE-származékokkal. A hibasávok 3 független kísérlet átlagának standard hibáját jelentik. Ezt az ábrát Oller-Salvia és mtsai engedélyével módosították. 2018 21. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Vita

A trasztuzumab (CypK) 2 előállításához szükséges, az ebben a jegyzőkönyvben leírt átmeneti expressziós eljárás egyszerű és nagy modularitást tesz lehetővé. A kapott hozamok megegyeznek az akadémiai környezetben elvártakkal 27, és stabil sejtvonalakat lehet létrehozni a termelés teljesítményének további javítása érdekében 21. Az expresszió során az 5 mM-nél kisebb CypK-koncentrációk kevesebb ncAA beépülést eredményezhetnek, és a nagyobb mennyiségek befolyásolhatják a sejtek növekedését és csökkenthetik az antitesttermelést. A CypK, mint szabad aminosav, vízben kevéssé oldódik, ezért először fel kell oldani 100 mM 0,1 M NaOH-ban, majd hozzá kell adni a táptalajhoz. A CypK hígítása a táptalajban és a sejtekhez történő hozzáadás előtt elengedhetetlen a közeget sósavval semlegesíteni, a sterilizáláshoz pedig a szűrőt. Ezt követően az e jegyzőkönyvben meghatározott transzfekciós reagensek használata és a gyártó által ajánlott inkubációs idők betartása fontos a nagy áteresztőképességű expresszió szempontjából. A humán antitestek tranziens expressziójával kapcsolatos további információkért az olvasó más közzétett 31., 32. protokollban található .

A leírt ADC technológia lehetővé teszi a lizin ciklopropén-származékának hatékony és specifikus beépítését az IgG1-be. Könnyű tisztítás után az antitesteket gyorsan konjugálhatjuk tetrazint tartalmazó molekulákkal, így homogén termékeket kapunk. A minimális fogantyújú ciklopropén kis mérete és nagy reakcióképessége miatt ennek a módszernek lehetővé kell tennie a szterikusan akadályozott töltetek konjugálását. A kapott immunkonjugátumok stabilak a szérumban, nagyon erősek és szelektívek. Általánosságban a CypK lehetővé teszi az antitestek és más konjugált fehérjék gyors, specifikus és stabil bioortogonális kapcsolását terápiában vagy diagnózisban történő alkalmazásra.