Rövid leírás

1 Az RNS vírus evolúciós dinamikája Samuel Ojosnegros Martos, 2008. november 14. DOKTORI TÉZISEK Universidad Aut & o.

dinamikája

Leírás

Az RNS vírusok evolúciós dinamikája Samuel Ojosnegros Martos, 2008. november 14

DOKTORI TÉZISEK Universidad Aut´omaoma de Madrid Természettudományi Kar Molekuláris Biológia Tanszék

Samuel Ojosnegros Martos, a biológia szakon végzett hallgató beszámolója a madridi autonóm egyetem doktori fokozatának megpályázására. Madrid, 2008. november.

A jelen doktori értekezésben bemutatott munkát a "Severo Ochoa" Molekuláris Biológiai Központban végezték Dr. Esteban Domingo Solans irányításával, és az Oktatási Minisztérium egyetemi személyi képzésének (FPU) előtti doktori ösztöndíja finanszírozta. és a Tudomány.

Sergióhoz A szüleimhez

Köszönök mindent. RNAázok nem léteznek, totális tudomány. totális tudomány.

SBF: Magzati szarvasmarha-szérum SDD: Sűrűségtől függő szelekció SPC: Poliklonális szérum AIDS: Szerzett immunhiányos szindróma ST: Standard genom 5 'UTR és 3' UTR: Az 5 'és 3' végek nem transzlált régiói, ill. VFA: Láb- száj- és körömfájás vírus HCV: Hepatitis C vírus HIV-1: 1. típusú emberi immunhiányos vírus VSV: Vesikuláris stomatitis vírus ∆: Törlés

ACM: monoklonális antitest AZC: 5-azacytidin (AZC) BHK-21: Hörcsög vesesejtek (baba hörcsög vese) cDNS: DNS másolat d: Közepes távolságú DEAE: Dietil-aminoetil Df: Szabadsági fokok, szabadsági fokok DI-k: Hibásan zavaró részecskék DMEM: Dulbecco módosított sas minimális táptalaj DNS: dezoxiribonukleinsav dNTP: 2'-dezoxinukleozid-5'-trifoszfát ecp: citopátiás hatás EDTA: etil diamin-tetracetátban FA: száj- és körömfájás FU: 5-Fluorouracil G: Guaniniumium hpe: Óra az elektroporáció után IRES: Belső riboszóma belépési helye Kb, Pb: Kilobázisok, bázispárok LCMV: Egér limfocita choriomeningitis vírus M: Molar MDI: A fertőzés sokasága MP: Maximum parsimony MV: Maximális valószínűség NJ: szomszéd csatlakozás nt: Nukleotid PAQ: Quasispecies PBS: Foszfáttal pufferolt sóoldat analízise PCR: Polimeráz láncreakció PFU: D-képző egységek e lemez PolyA: Poliadenilát Poli: Polikribocitidilát PV: Poliovírus R: Ribavirin RNS: Ribonukleinsav RpRd: RNS polimerázfüggő RNS RT: Fordított transzkriptáz RT-PCR: Fordított transzkripciós reakció, majd amplifikáció reakcióval SARS polimeráz láncban: Akut súlyos légúti szindróma

Aminosav kód A (Ala) Alanin I (Ile) Izoleucin R (Arg) Arginin C (Cys) Cisztein K (Lys) Lizin S (Ser) Szerin D (Asp) Aszpartikus L (Leu) Leucin T (Thr) Treonin E (Glu) Glutamic M (Met) Metionin V (Val) Valine F (Phe) Fenilalanin N (Asn) Asparagin W (Trp) Trypt ofano G (Gly) Glicin P (Pro) Proline Y (Tyr) Tirozin H (His ) Histidin Q (Gln) glutamin

Tárgymutató 1. Összegzés (összefoglaló angol nyelven)

15 15 15 15 17 17 18 19 19 21 22 23 24 25 25 25 26 28

4. Anyagok és módszerek 4.1. Eukarióta sejtkultúra. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. A használt VFA változatai. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Fertőzések . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1. Sejtes egyrétegű fertőzések folyékony közegben. . . . . . . . . . . . . 4.3.2. BHK-21 sejtekben félszilárd agar táptalajon történő vírusolás. . . . . . 4.3.3. Titerkorrekció kétféle részecske kiegészítésével fertőző defektusok populációinak plakkjában . . . . . . . . . . .

28 30 30 30 30 31 31 31 32 33 33 34 37

40 40 40 41 41 42

43 43 43 43 44 44 44 44 45 45 45 45 45 45 45 46 46 46 46 49 49 50 51 51 51 52 52 52 52 54 54 56 56 56 57 57 57 57 58 58 59 59

112 112 113 113 114 114

. 114. 115. 115. 116. 116. 117. 117. 118. 118 . . . . . . .

119 120 121 121 121 122 123

8. Filogenetikai függelék

9. Matematikai melléklet: a vírusdinamika alapmodellje a 9.1. Két vírus versengése sejttenyészetben. . . . . . . . . 9.2. In silico dinamika az in vitro dinamikával szemben. . . . . . . . . . . 9.2.1. Kezdeti feltételek. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.2.2. A vírus mennyiségének meghatározása. . . . . . . . . 9.2.3. Modell előrejelzések és kísérleti eredmények. 9.3. Modellparaméterek. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4. Matematikai elemzés. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.1. Természetvédelmi törvény. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.2. Paramétertér . . . . . . . . . . . . . . . . . .

128 129 129 131 131 132 132 134 134 135

10. Számítógépes 136. melléklet 10.1. Forráskód . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 11. Irodalomjegyzék

Összegzés (összefoglaló angol nyelven)

Az RNS vírusok genetikai variabilitása Az RNS vírusok genetikai variabilitásának molekuláris alapjai.

Mutációs frekvenciák

Relatív biológiai hatékonyság

1. ábra: Az RNS vírusok quasispecies struktúrájának vázlata. A központi ábra az RNS vírusokra jellemző genomok heterogén eloszlását ábrázolja. A vonalak a virális genomokat, a vonalak feletti szimbólumok pedig mutációkat képviselnek. A mutánsok spektruma alatt a konszenzus vagy az eloszlás átlagos szekvenciája van feltüntetve. A kiinduló kvázifajok a közepén fejlődhetnek a biológiai hatékonyság növekedése felé (széles nyíl), ha nagy populációméretű passzázsoknak vannak kitéve, vagy a biológiai hatékonyság csökkenése (kis nyilak) felé, ha egymást követő populációs szűk keresztmetszetek vagy lemez-to-top lemez elhalad. A nagy populációnagyságú országok előnyben részesítik a variánsok közötti versenyt, és a vírus relatív biológiai hatékonyságának növekedéséhez vezetnek. A plakk-plakk útvonalak káros mutációk sztochasztikus felhalmozódásához és a vírus relatív biológiai hatékonyságának csökkenéséhez vezetnek.

Lahue 1996). Továbbá az RNS-polimerázok hajlamosak csúszni homopolimer szakaszok másolásával, deléciókat és inszerciókat okozva (Bebenek és Kunkel 1993). Vannak olyan sejtfehérjék családjai is, a citozin és az adenozin deaminázok (APOBEC és ADAR), amelyek képesek a vírusgenomok vagy transzkriptumok szerkesztésére, mint a Hepatitis δ, humán immunhiányos vírus (HIV) esetében (Harris és mtsai 2003; Mangeat és mtsai 2003; Zhang és mtsai 2003), hepatitis B (Suspene és mtsai 2005), vagy akár olyan DNS vírusokban is, mint a papillomavírus (Vartanian és mtsai 2008). Ezek a tevékenységek egyes RNS vírusok genetikai variációinak forrását is jelenthetik. 2.1.3.

Rekombináció és génátrendeződések.

A populáció szerkezete - kvázifajok

Az RNS vírusok magas hibaaránya, rövid genomi replikációs idejük és magas populációméretük, valamint a természetes szelekció hatására egy szélsőséges darwini rendszert konfigurálnak, amelyben az új variánsok létrehozásának sebessége meghaladja azok sebességét. fix (Manrubia et al. 2005). Az RNS-vírusokban a gyors szelekciós mutációnak ez a dinamikája szükségszerűen több változat együttes létezéséhez vezet egy populációban, amely az egymással szorosan kapcsolódó, de nem azonos egyedek halmazát képezi (1. ábra). Ehhez a struktúrához 17

A mutánsok spektrumának fontossága

A mutánsok spektrumának fontosságát a közelmúltban két párhuzamos vizsgálat emelte ki, amelyeket a gyermekbénulás vírus (PV) mutánsával végeztek (Pfeiffer és Kirkegaard 2003; Arnold és mtsai. 2005), amelyek a hűség növekedését mutatták anélkül, hogy veszélyeztetnék annak replikatív kapacitás. Ez a mutáns kisebb fajú kvázifajt generált, mint a vad típusú vírus. A fertőzött, fogékony egerekben a vírus diverzitás csökkenése a neurotropizmus elvesztéséhez, és ezáltal egy gyengített fenotípushoz vezetett (Pfeiffer és Kirkegaard 2005; Vignuzzi et al. 2006). A kvázifajok sokféleségének kiterjesztése kémiai mutagenezissel helyreállította a neurotropizmust és a patogenezist. Ezek az eredmények közvetlen kapcsolatot hoznak létre a mutációs sebesség, a mutánsok spektrumának bonyolultsága és a vírus patogenezise között in vivo. 2.1.6.

A filogenitás mint a kvázifajok szerkezetének tanulmányozásának eszköze.

A vírus biológiai hatékonysága: alkalmasság

A vírusvariáns biológiai hatékonysága vagy alkalmassága az adott változat várható hozzájárulása az adott környezetben a következő generáció utódaihoz (Maynard Smith 1998). Két

A biológiai hatékonyság változásának folyamata

1. vírus/2. vírus

102 101 100 10-1

y = 0,318 e0,917x R2 = 0,9218

3. ábra: A vírusverseny tipikus sémája a relatív alkalmasság meghatározásához. A grafikon két vírusvariáns arányát mutatja egy kezdeti inokulumban (0. passzus) és egy citolitikus fertőzés végén (több mint 4 passzus alatt). Minden pont az előző fertőzés víruskészítményéből származó fertőzés eredményét jelenti. A grafikon meredeksége az egyes genotípusok arányának időbeli változását mutatja. Tekintettel arra, hogy az x növekedése (a passzok száma) minden ponton 1, a meredekség ebben az esetben e0.917 = 2.6 = relatív fitneszérték.

Fitness részletesen

fontos, amely megváltoztathatja a verseny eredményét, olyan sejtekben, amelyeket különböző vírusvariánsok társfertőznek (Baulcombe 1996; Bull és Molineux 1992; Chao 1997; Chao és Tran 1997; Gonzalez-Lopez és mtsai 2004; Grande-Perez és mtsai. 2005b; Holland 1990; Novella és mtsai 2004; Russel 1992; Sachs és Bull 2005; Turner és Chao 1998; Turner és Chao 1999; Wilke és mtsai 2004b; Perales és mtsai 2007; Valcarcel és Ortin 1989; Holland és mtsai. ., 1989), a fitneszpróbák nagyon különböző eredményeket vonhatnak le a kísérletben megengedett koinfekció mértékétől függően. 2.2.3.

A vírus fitnesz stratégiáinak alakulása: sűrűségfüggő szelekció