A szöveg kész

(1) BIOKÉMIAI ÉS GYÓGYSZERÉSZETI TUDOMÁNYOK KARA UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO. Rosario Molekuláris és Sejtbiológiai Intézete. Biológiai tudományok doktori értekezése. Szelektív szenzor/operátor felismerés monovalens fém válaszszabályozókban Salmonella enterica-ban Bemutatja: María Victoria Humbert licencigazgató: Dr. Fernando C. Soncini. Rosario, Argentína 2014.

szenzoroperátor

(2) 1. Szelektív érzékelő/operátor felismerés egyértékű fémválasz-szabályozókban a Salmonella enterica-ban. María Victoria Humbert Diplomás biotechnológiai karon, Biokémiai és Gyógyszerésztudományi Karon, Rosario Nemzeti Egyetemen. Ez a tézis a biológiai tudományok doktori fokozatának megszerzéséhez szükséges követelmények részeként kerül bemutatásra a Rosario-i Nemzeti Egyetemen, és korábban nem került bemutatásra ahhoz, hogy újabb diplomát szerezzen ezen vagy egy másik egyetemen. Tartalmazza a Rosario Molekuláris és Sejtbiológiai Intézet (IBR-CONICET), a Biokémiai és Gyógyszerésztudományi Kartól függő kórokozó mikroorganizmusok molekuláris biológiája területén végzett kutatások eredményeit, 2009. június 4. között. és 2014. március 27-én, Dr. Fernando C. Soncini irányításával.

(3) 2. Családomnak és barátaimnak.

(6) Index. MUTATÓ RÖVIDÍTÉSEK. 10. BEVEZETÉS. 13. 1. A Salmonella nemzetség 1.1. A szalmonella fertőző ciklusa és a környezetben való túlélés. 14 15. 2. Az Escherichia nemzetség. 16. 3. Salmonella enterica és Escherichia coli mint vizsgálati modell. 17. 4. Átírási szabályozók. 18. 4.1. MerR transzkripciós szabályozók családja. 18. 4.2. A MerR család szabályozóinak felépítése. 19. 4.2.1 HTH domén: közös nevező a transzkripciós szabályozókban 4.3. A MerR szabályozók és kölcsönhatásuk a DNS-sel. 20 23. 4.3.1 Tipikus MerR szabályozók: Klasszikus transzkripciós szabályozási paradigma 4.3.2 Nem konvencionális MerR szabályozók. 23 26. 4.3.2.1 CarA/CarS szabályozók. 28. 4.3.2.2 LitR szabályozók. 31. 4.3.2.3 A szabályozók MlrA. 32. 4.3.2.4 BluR szabályozók. 37. 4.3.2.5 Hsp_2 szabályozók. 37. 5. Fémek: esszenciálisak, nem alapvetőek és mérgezőek. 38. 5.1. A fémek osztályozása. 38. 5.2. Homeosztázis stratégiák/átmenetifémekkel szembeni ellenállás. 39. 6. Réz homeosztázis 6.1. 6.2. Réz homeosztázis az E. coliban. 40 41. 6.1.1 A cue regulon. 42. 6.1.2 A regulon cus. 6.1.3 A réz PcoABCD-vel szembeni ellenállás alternatív rendszere. 44. Réz homeosztázis Salmonella-ban 6.2.1 A jel szabály. 45 45. 5.

(10) Index. 2.1. Az STM1266 magas szintje csökkenti a mozgékonyságot. 149. 2.2. Az STM1266 túlzott expressziója serkenti a biofilmek képződését. 150. 2.3. Az STM1266 indukciója növeli a termelést és a szekréciót. 2.4. cellulóz. 152. Az STM1266 magas szintje rezisztenciát kölcsönöz a sztreptomicinnel szemben. 153. 3. STM1266 és annak szerepe a biofilm képződésének szabályozásában. 155. Megbeszélés. 158. 1. A csgD transzkripciós szabályozásának összehasonlító elemzése E. coliban és S. enterica-ban. 159. 2. GGDEF doménnel rendelkező fehérjék: a csgD pozitív szabályozása. 164. 3. EAL doménnel rendelkező fehérjék: a csgD negatív szabályozása. 166. ÁLTALÁNOS KÖVETKEZTETÉSEK. 168. ÖSSZEFOGLALÓ. 174. BIBLIOGRÁFIAI HIVATKOZÁSOK. 176. 9.

(11) Rövidítések. Rövidítések A. Amp. Abs. Abszorbancia DNS. Dezoxiribonukleinsav. AHL. N-acil-homoserin-lakton. Amp. Ampicillin. RNS. Ribonukleinsav. ARNPol. RNS-polimeráz. ATP. Adenozin-5-trifoszfát. BCIP. 5-bróm, 4-klór, 3-indofoszfát. BSA. Szarvasmarha szérum albumin. Cbl. Kobalamin. c-di-GMP. bisz (3 '; 5') -guanozin ciklikus monofoszfát. Vö. Végső koncentráció. Ci. Curie. CIM. Minimális gátló koncentráció. Cm. Klóramfenikol. C-terminál. Karboxil-terminális. DGC. Diguanilát-cikláz. DNáz I. Dezoxiribonukleáz I. DTT. Ditiotreitol. EC. Escherichia coli. EGTA. Etilén-glikol-bisz (p-amino-etil-éter) N, N, N ', N'-tetraecetsav. EMSA. Elektroforetikus mobilitási késleltetési teszt. Strep. Sztreptomicin. Fw. Közvetlen. 10.

(12) Rövidítések g. Gramm. g/l. Gramm literenként. HPLC. Nagynyomású folyadékkromatográfia. HTH. Helix-turn-helix. IPTG. Izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid. kA. Egyensúlyi állandó (asszociáció). kb. Kilobase. kD. Egyensúlyi állandó (disszociáció). Km. Kanamicin. LB. Luria Bertani. NB. Tápanyag húsleves. NBT. Nitrotetrazolium kék. nt. Nukleotid N-terminál. Aminoterminál. ONPG. O-nitrofenil-galaktopiranozid. ORF. Nyitott olvasókeret. o. Plazmid. P. promóter. pb. Alappárok. PCR. Polimeráz láncreakció. PDE. Foszfodiészteráz. p) ppGpp. Guanozin-pentafoszfát. p/v. Súly térfogatban. r. Fluoreszcencia anizotropia. A. Ellenálló. NMR. Nukleáris mágneses rezonancia. fordulat. Percenkénti fordulatszám. tizenegy.

(13) Rv. Rövidítések Vissza. SDS. Nátrium-dodecil-szulfát. SN. Supernatáns. STM. Salmonella Typhimurium. Tc. Tetraciklin. U. Unit. vagy. a . Önkényes egységek. U. M . Miller egységek. UFC. Telepképző egységek. UV. Ultraibolya. V. Volts. V f. Végső kötet. v/v. Kötet térfogat szerint. wHTH. Helix-fordulószárnyú spirál. X-gal. 5-bróm-4-klór-3-indolil-P-D-galaktopiranozid. α. Helix-α. β. Β-lap. Δ. Törlés 12.

(25) Bevezetés. (Zheleznova Heldwein és Brennan, 2001). A szabályozó és a koaktivátor kölcsönhatása nem befolyásolja jelentősen a DNS iránti affinitását. Ehelyett konformációs változást okoz, amelyet intramolekulárisan továbbítanak a DNS-kötő doménbe, és végül a görbület ellazulását és a DNS kikapcsolódását eredményezi az operátor szekvenciában, ami a -35 és -10 dobozok átrendeződését eredményezi. az RNAPol által megnyitott komplex képződése és az ebből következő transzkripció megindítása (5. ábra) (Ansari et al., 1992, Outten et al., 1999; Zheleznova Heldwein és Brennan, 2001; Newberry és Brennan, 2004). a DNS letekerése az AT bázispár hidrogénkötéseinek gyengüléséből ered, amely általában a kezelő szimmetrikus diódájának közepén található, lehetővé téve a torzulást annak közepén. Ezt az alapeltolódást stabilizálná a fehérje-maradékok és a DNS foszfátváza közötti kölcsönhatás. Mivel a palindrom szekvencia központi bázispárjának identitása adeninként vagy timinként konzerválódik a legtöbb MerR promóterben, és hozzáteszi, hogy ezek nem befolyásolják a regulátor affinitását. 24.

(27) Bevezetés. 4.3.2 Nem konvencionális MerR szabályozók A közelmúltban végzett tanulmányok e család különböző tagjai, például a CarA, LitR, MlrA, BluR és HspR_2 között mutatják be a DNS-sel való kölcsönhatás mechanizmusait, amelyek eltérnek az előző szakaszban említett egységes cselekvési modelltől. A szabályozók ebben az újonnan jellemzett részhalmazában a szabályozó akár aktivátorként, akár célgénjeik represszoraként működhet. A cselekvési modell magában foglalna más szabályozó fehérjék részvételét is, amelyek versenyben állnak a MerR-típusú szabályozó interakciójáért a DNS-ért, vagy megakadályozzák annak kölcsönhatását a kezelőszekvenciával, egy fehérje-interakció révén közvetlenül kapcsolódnak a DNS-kötő doménhez. -protein, és ezáltal kiszorítja a MerR szabályozót a célhelyéről. Ezenkívül az atipikus MerR szabályozók által felismert cél operátor szekvenciák összehasonlító elemzése (7-B. Ábra) jelentős különbségeket tár fel az e család jellemző operátoraként elismertekkel, ami érvényteleníti a közös strukturális és funkcionális mechanizmust leíró általános szabályok létrehozásának lehetőségét. az összes MerR transzkripciós szabályozó között.

(28) Bevezetés. A nem konvencionális MerR szabályozók által felismert operátorok esetében a szimmetrikus dióda a -35 és -10 dobozoktól eltolódva helyezkedik el, általában a -35 dobozra helyezve, vagy attól felfelé (7-B. Ábra). Ez a strukturális jellemző, amely a legtöbb MerR operátornál szokatlan (7-A. Ábra), azt jelzi, hogy a mechanisztikus szabályozási modell, általában az elnyomás, eltérne a hagyományos vagy tipikus MerR típusú szabályozóknál javasoltaktól. A nem hagyományos szabályozóknál ez nem függ a kezelő konformációs átkonfigurációjától és a szabályozó által közvetített -35 és -10 dobozok áthelyezésétől, ami két különböző szabályozási modellt javasol ezen a szabályozó családon belül. 27.

(29) Bevezetés. Filogenetikailag rokon és szerkezetileg analóg, különösen az N-terminális DNS-kötő domén szintjén (8. ábra) 4.3.2.1 CarA/CarS szabályozók Az atipikus MerR transzkripciós szabályozók csoportján belül a CarA/LitR típusú szabályozókat különböztetjük meg, amelyek a C-terminális doménjükben a kobalaminhoz (B12-vitamin) való kötődés motívumát mutatják be. Részt vesznek a nem-fototróf baktériumok (Actinobacteriumok és Gram-negatív baktériumok, például Pseudomonas, Shewanella és Vibrio) fénymodulált transzkripciós szabályozásában. A fotooxidatív stressz gátlása karotinoidok, sárga, narancssárga vagy vörös pigmentek előállításával, amelyek megvédik a sejtet az oxigén szabad gyökök által okozott károsodásoktól, számos nem fototróf baktérium fotokapcsolatilag élettani jellemzője. A baktériumfajok egy fontos csoportja megvilágításkor felhalmozza a pigmentek ezen osztályát. Ez egy bizonyos szabályozó rendszer evolúciós megőrzését sugallja, amely fényjelet fordít a karotinoid bioszintézishez szükséges gének expressziójába. E szabályozási rendszerek részletei még mindig nem ismertek.

(35) Bevezetés. közvetett cellulóz bioszintézis az AdrA transzkripciós aktiválásával. Ez a fehérje diguanilát-cikláz aktivitással rendelkezik, ezért képes stimulálni a mindenütt jelenlévő bakteriális szignálmolekula, a ciklikus bisz (3 ', 5') -guanozin-monofoszfát (c-di-GMP) termelését. Ez a metabolit ezután kulcsfontosságú másodlagos hírvivőként működik a cellulóz és valószínűleg más exopoliszacharidok bioszintézisében (12-A. Ábra) .A CsgD szabályozását kulcsfontosságúnak tekintik a planktonikus életforma és a biofilmek képződése közötti döntéshozatalban. Az MlrA nem az egyetlen tényező, amely részt vesz a csgD transzkripciós szabályozásában, de vannak más szabályozók, amelyek modulálják a csgD expresszióját nagyon különböző indukáló körülmények között: az álló növekedési fázisban a tápanyagok hiánya miatt, a mikroaerobiosisban, az aerobiosisban minimális közegben lúgos pH-n (pH 8,5), alacsony ozmolaritás mellett és hőmérsékleten (28 ° C). Ezért ismerik el a csgD promótert az E. coli egyik legösszetettebb promótereként (Gerstel et al., 2003; Ogasawara et al., 2010; Ogasawara et al., 2011). A csgD promóter régióban lévő MlrA kötőszekvencia (7-B. Ábra) egy 11 bp fordított ismétlésből áll, 12 bp intervallummal (MlrA-box), és ez az. 3. 4.