sejtpopulációk

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Háttér:
  • Mód:
  • Eredmények:
  • Következtetés:
  • Fő
  • Eredmények
  • NK sejtpopuláció mérete
  • Az Intelectin-2 mRNS expressziója PBMC-ből izolált NK sejtekben
  • NK-sejtek citotoxicitása
  • NK-sejtekhez kapcsolódó génexpresszió PBMC-ből izolált NK-sejtekben
  • Vita
  • Mód
  • Kémiai termékek
  • bLf
  • Diétás kezelések és állatprotokoll
  • Minta kollekció
  • PBMC izolálás
  • A lépsejtek és az MLN teljes izolálása
  • NK sejtek izolálása és fenotípusos azonosítása a tisztaság érdekében
  • NK sejt-citotoxicitási vizsgálat áramlási citometriával
  • A vér mononukleáris sejtjeinek, valamint az összes MLN sejt és a lép fenotípusos azonosítása
  • NK sejt gén expresszió
  • Statisztikai elemzés
  • Nyilatkozat a pénzügyi támogatásról
  • Kinyilatkoztatás
  • Kiegészítő információk
  • Powerpoint fájlok
  • Kiegészítő S1 ábra.

Tárgyak

  • NK sejtek
  • Táplálás
  • Gyermekgyógyászat

Összegzés

Háttér:

A természetes gyilkos (NK) sejtek a veleszületett immunvédelmi rendszer alkotórészei, szintjük különbözik a csecsemők és a tápszerrel táplált csecsemők (FF) között. A laktoferrin (Lf) ex vivo modulálja az NK-sejtek citotoxicitását. Feltételeztük, hogy a szarvasmarha Lf (bLf) étrendje növeli az NK sejtpopulációt és a citotoxicitást.

Mód:

A malacokat 21 napon keresztül kocákkal (SR), FF vagy 1 g/l táplált bLf (LF) nevelték. Az NK sejteket (CD3 - CD4 - CD8 +) a vérben (perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC)), a lépben és a mesenterialis nyirokcsomóban (MLN) áramlási citometriával határoztuk meg. A PBMC NK sejteket citotoxikus aktivitásra teszteltük a cél K562 sejtek ellen ex vivo táptalaj (nem stimulált), interleukin-2 vagy bLf jelenlétében. Az NK sejt mRNS expresszióját kvantitatív reverz transzkripciós PCR-rel határoztuk meg.

Eredmények:

Az SR és LF malacokban több NK-sejt volt az MLN-ben (P = 0,0097) és a lépben (P = 0,0980), mint az FF malacokban. PBMC-ben az SR malacok több NK-sejtet tartalmaztak, mint az FF malacok (P = 0,0072); Az LF malacok köztesek voltak, és nem különböztek az FF vagy SR malacoktól. Az NK sejt intellinin-2 mRNS expressziója 2,5-szer magasabb (P = 0,0095) volt LF-ben, mint SR vagy FF malacokban. Az SR malacokban található NK sejtek magasabb citotoxikus aktivitást mutattak (P

Az Intelectin-2 mRNS bősége nagyobb volt a 21 napos bLf-vel táplált malacok természetes gyilkos sejtjeiben (LF, n = 3), mint azoknál, akik kocákkal (SR, n = 7) vagy tápszerrel (FF, n = 6) állatok. Az intelektin-2 normalizált értékeit úgy számítottuk ki, hogy az átlagos célmennyiséget elosztottuk a referenciagén (peptidilprolil-izomeráz A) átlagos mennyiségével. A hajtáskülönbséget minden méréshez úgy számoltuk, hogy a normalizált célértékeket elosztottuk az FF sertések átlagos normalizált célértékével. Az adatokat a ráncok különbségének átlag ± SD-ként fejezzük ki az FF állatokhoz viszonyítva. * P ≤ 0,05. bLf, szarvasmarha-laktoferrin.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

NK sejtek citotoxicitása

SR állatokból származó PBMC-ből izolált, interleukin-2 (IL-2) vagy bLf-vel nem stimulált vagy stimulált NK-sejtek magasabb citotoxikus aktivitást mutattak (P

A 21 napos korban nevelkedett kocákból izolált természetes gyilkos (NK) sejtek citotoxicitása (SR; n = 11; fekete), táplált tápszerrel (FF; n = 14; fehér) és táplált bLf-vel (LF; n = 11 szürke malac). A perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC) NK sejtjeit vagy nem stimuláltuk (Unst), vagy stimuláltuk interleukin-2 (IL-2) (20 ng/ml) vagy Lf (25 μg/ml) alkalmazásával, és 48 órán át inkubáltuk DiOC 18 jelzéssel, K562 jelzéssel. célsejtek: a célsejt-arány 10: 1. Az inkubáció végén propidium-jodidot (PI) adtunk az elhalt sejtek jelölésére. A citotoxicitást elpusztított célsejtként (PI + DiOC 18 +) jelentik a teljes célsejt százalékában (DiOC 18 +). Az adatokat átlag ± SD-ként fejezzük ki. Proc generalizált lineáris modell (GLM) teljes modell, P † szignifikáns különbségeket jelez az étrendek között. bLf, szarvasmarha-laktoferrin.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

NK-sejtekhez kapcsolódó génexpresszió PBMC-ből izolált NK-sejtekben

Annak érdekében, hogy meghatározzuk azokat a lehetséges molekuláris mechanizmusokat, amelyek hozzájárulhatnak az FF és LF állatok NK-sejtjeinek citotoxikus aktivitásának csökkenéséhez, kvantitatív reverz transzkripciós PCR-t hajtottunk végre a CD3-CD4-CD8 sejtekből kivont RNS-en. + Stimulálatlan perifériás vér NK ( 3. ábra ) Az NK-sejtek effektormolekulája, a perforin mRNS bősége háromszor, illetve hatszor alacsonyabb volt az FF és az LF malacok NK sejtjeiben, mint az SR malacokban (P = 0,0038, 3a. Ábra ). Ezenkívül a 2. csoport NK-tagjának (NKG2D), az NK-sejteken található aktiváló receptornak, a gyilkos sejtek lektinszerű receptorának K alcsaládjának 1. receptoraként ismert aktiváló receptor expressziója 3 volt, Ötször alacsonyabb az FF állatok NK-sejtjeiben, mint az SR-állatokéban, míg az NKG2D receptor gén expressziója az LF állatok NK-sejtjeiben közepes volt, és nem különbözött szignifikánsan egyik csoporttól sem ( 3b. Ábra ).

Perforin ( nak nek ) és az NK 2. csoportba tartozó D (NKG2D) receptor ( b ) Az mRNS bősége a 21. napon tenyésztett kocákból izolált természetes gyilkos sejtekben (SR, n = 7), tápszerrel (FF, n = 4-5) és bLf-vel táplált malacokban (LF, n = 3). A célgének normalizált értékeit úgy számítottuk ki, hogy a kívánt átlagos mennyiséget elosztottuk a referenciagén átlagos mennyiségével. A hajtáskülönbséget minden méréshez úgy számoltuk, hogy a normalizált célértékeket elosztottuk az FF sertések átlagos normalizált célértékével. Az adatokat átlag ± SD-ként fejezzük ki. A különböző szubindexek (*, †, ‡) szignifikáns különbségeket jeleznek P ≤ 0,05 esetén. bLf, szarvasmarha-laktoferrin.

Teljes méretű kép

  • Töltse le a PowerPoint diát

Vita

A diéta általában jelentős hatással volt az NK-sejtek populációjára és aktivitására. Az anyatejjel táplált malacoknak az NK-sejtek populációnagysága nagyobb volt a vérben és az immunszövetekben, és magasabb a citotoxikus aktivitásuk (PBMC), összehasonlítva az FF-malacokkal. A bLf NK-sejtek fejlődésére gyakorolt ​​általános hatása azonban ebben a vizsgálatban nem volt meggyőző. A bLf étrend-kiegészítése nem növelte az NK-sejtek citotoxicitását; az a tény azonban, hogy az LF malacokban nagyobb a perifériás vér NK sejtjeinek száma, magasabb LfR expresszióval, javíthatja az újszülött immunvédelmét. Ezenkívül a 21 napon túli vagy annál hosszabb adag bLf-adagolás hatékonyabb lehet a veleszületett immunválasz fokozásában ezeknél az állatoknál, mivel az ebben a vizsgálatban alkalmazott dózis (1 g/l) a jelen lévő alsó végén van. emberi anyatej (

2,1 g/l). Ezért jövőbeni vizsgálatokra van szükség annak megállapításához, hogy a bLf immunszabályozó szerepe az NK-sejtek aktivitásában függ-e egy bizonyos feltételrendszertől, azaz a kórokozótól, az életkortól vagy a fajtól. Mivel az NK-sejtek fontos első védelmi vonalat jelentenek a fertőzéssel szemben, az olyan tényezők megértése, amelyek növelik számukat és fokozzák az ölési képességüket, táplálkozási eszközökkel jobban megvédhetik az FF-ben szenvedő csecsemőket.

Mód

Kémiai termékek

Minden vegyszert a Sigma-Aldrich-től (St Louis, MO) vásároltunk, hacsak másképp nem jelezzük.

Porított bLf-t (98% -os tisztaság) a DMV International-től (FrieslandCampina, Hollandia) nyertünk. Az összes vas-tartalom 120 mg/kg por volt, ami 11,9% -os telítettséget jelentene, ha az összes vasat bLF kötné. A BLf-et kétszer desztillált ionmentes vízben oldjuk 100 g/l koncentrációban. A képlet elkészítése során 1 ml képlethez 10 ml ezt az oldatot adunk 1 g/l bLf végkoncentrációhoz.

Diétás kezelések és állatprotokoll

Minta kollekció

A szülés utáni 21. napon a malacokat telazol intramuszkuláris injekciójával (7 mg/ttkg; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA) injektáltuk, és a vért intrakardiális punkcióval heparint tartalmazó vákuumcsövekben vettük fel (BD Biosciences, San José, CA ) a PBMC izolálásához. A malacokat nátrium-pentobarbitál (72 mg/testtömeg-kg, Fatal Plus; Vortech Pharmaceuticals, Dearborn, MI) intrakardiális injekciójával eutanizálták. Eutanázia után lép- és MLN-mintákat gyűjtöttünk a teljes sejtszigeteléshez.

PBMC izolálás

A vért 2: 1 arányban hígítottuk RPMI-1640-gyel (Invitrogen, Gibco, Grand Island, NY), Ficoll-Paque Plus-ba (GE Healthcare, Piscataway, NJ) rétegeztük és 400 g-vel 40 percig 20 ° C-on centrifugáltuk. PBMC-ket a gradiens felületről gyűjtötték. A vörösvérsejteket lízispuffer (0,15 mol/l NH4CI, 10 mmol/l KHCO3 és 0,1 mmol/l Na2 EDTA) alkalmazásával lizáltuk. A PBMC-ket háromszor mostuk Hank pufferolt sóoldatából (Ca 2+ nélkül, Mg 2+ nélkül (HBSS; Invitrogen, Gibco)) mosó pufferben, amelyet 2% BSA-val, 1 mmol/l Na 2 EDTA-val, 50 μg/ml ml gentamicin (Invitrogen, Gibco), penicillin 1000 Egység/ml és sztreptomicin 100 μg/ml). A PBMC-ket teljes RPMI-1640-ben szuszpendáltuk (10% FBS, 2 mmol/l glutamin, 50 μg/ml gentamicin, 1 mmol/l nátrium-piruvát, 20 mmol/l HEPES (Invitrogen, Gibco), 1000 U/ml penicillin és 100%). μg/ml sztreptomicin). Az életképes sejtek számát tripánkékkel (Invitrogen, Gibco) történő festés után megszámoltuk. A sejteket fenotipizáljuk és áramlási citometriával számszerűsítjük, vagy az NK-sejtek izolálására használjuk az alábbiakban leírtak szerint.

A lépsejtek és az MLN teljes izolálása

A lép- és az MLN-mintákat összegyűjtöttük és jégen tároltuk antibiotikumokat tartalmazó gyűjtőpufferben a feldolgozásig. A szöveteket háromszor mostuk (PBS (Invitrogen, Gibco), 50 ug/ml gentamicin, 1000 egység/ml penicillin és 100 ug/ml sztreptomicin). A megmosott szöveteket C-csövekbe (Miltenyi Biotec, Auburn, Kalifornia) helyeztük 10 ml Hank pufferolt sóoldatával, majd egy Gentle MACS (Miltenyi Biotec) alkalmazásával felvágtuk. A kapott sejtoldatokat 100 µm-es sejtszűrőn (BD Falcon, San Jose, CA), majd egy 40 µm-es sejtszűrőn (BD Falcon) szűrjük. A vörösvértestek lizálása után az izolált sejteket háromszor mossuk mosópufferben, és szuszpendáljuk a teljes RPMI-1640-ben. Az életképes sejtek számát tripánkékkel (Invitrogen, Gibco) történő festés után megszámoltuk. A sejteket ezután áramlási citometriával fenotipizáljuk az alábbiakban leírtak szerint.

NK sejtek izolálása és fenotípusos azonosítása a tisztaság érdekében

NK sejt-citotoxicitási vizsgálat áramlási citometriával

A vér mononukleáris sejtjeinek, valamint az összes MLN sejt és a lép fenotípusos azonosítása

NK sejt gén expresszió

A teljes RNS-t extraháltuk és a PBMC-ből izolált NK-sejtekből TRIzol reagenssel (Invitrogen, Grand Island, NY) tisztítottuk a gyártó protokollja szerint. Az RNS-t spektrofotometriásán, Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL) alkalmazásával számítottuk 260 nm-en. Összesen 10 millió NK-sejtet használtak fel extrakcióhoz és állítottak elő

800-1 000 ng/μl RNS. Az RNS-koncentrációt RNáz-mentes víz (Invitrogen) segítségével 0,25 μg/ml-re állítottuk be, és az RNS minőségét Bioanalyzer (2100 modell; Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia) segítségével elemeztük az egyetem illinoisi WM Keck Center-jében. Valamennyi minta RNS-integritási száma> 6 volt.

A reverz transzkripciót Eppendorf Thermal Cycler (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) alkalmazásával hajtottuk végre. Minden reakció 3 μg teljes RNS-t és 10 μl nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet keveréket (Applied Biosystems, Foster City, CA) tartalmazott, amely 100 mmol/l dezoxiribonukleotid-trifoszfátot (dNTP), 10X RT puffert, 10X RT véletlenszerű primereket, MultiScribe Reverse-t tartalmazott. Transzkriptáz, RNáz-gátló és dietil-pirokarbonát (DEPC) víz (Invitrogen) 20 μL végtérfogatban.

Valós idejű kvantitatív PCR-t hajtottunk végre az ITLN-2 (Ss03374218_m1), a KLRK1 (NKG2DR; Ss03394782_g1) és a perforin (Ss03373694_m1), valamint a peptidilprolil-izomeráz A (Ss03392377_m1) Taqman expressziós elemzésével. A mintákat futtatásonként összesen 40 amplifikációs ciklusnak vetettük alá, és a fluoreszcencia intenzitását Taqman ABI 7900 géppel (Applied Biosystems) detektáltuk. Peptidilprolil-izomeráz A-t alkalmaztunk referenciagénként (31). Az eredményeket a relatív standard görbe módszerrel fejeztük ki. Röviden, soros hígításokat (1: 5 és 1:15, 625 között) készítettünk sertés NK sejt cDNS törzséből, és mindegyik lemezen futtattuk őket. Mindegyik mintát primerekkel három példányban futtattuk a célgén és a peptidilprolil-izomeráz A értékelésére. Az egyes célpontok normalizált értékeit úgy számítottuk ki, hogy a célmennyiség átlagát elosztottuk a peptidilprolil-izomeráz A mennyiségi átlagával. Minden mérésnél egy különbség számításakor kiszámítottuk a normalizált célértékeket a normalizált kalibrátor mintával (ebben az esetben az FF csoport átlagával). A statisztikai különbségek szempontjából tesztelt összes mintát ugyanazon a lemezen futtattuk.

Statisztikai elemzés

Az adatokat a Proc általánosított lineáris modelljével elemeztük az SAS-ban (9.2-es verzió; SAS Institute, Cary, NC). Az NK sejtpopuláció és a génexpressziós elemzések modellje diétát tartalmazott fő hatásként. Az NK sejtek citotoxicitásának modellje az étrend, a kezelés és az étrend × kezelés interakció hatását tartalmazta. Az adatok normális eloszlását a SAS-ban végzett normalitási teszt megerősítette, és a ≥0,75 Shapiro-Wilk-szám azt mutatta, hogy az értékek normálisan eloszlottak. Az adatokat átlag ± SD értékként adjuk meg. Összehasonlítások P-vel