1 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO DE PUNO BIOLÓGIATUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI SZAKASZTAL ANTIMIKOTIKUS HATÁS A Cinnamomum zeylanicum CANELA esszenciális olajának vitrójában ON Candida albican OESLIN PRESIS PRESES.
2 Nemzeti Egyetem DF.L ALTIPLANO DE PUNO KAR O [BIOLÓGIAI CIINCLES rmljila SZAKMAI DE biológia VffRO gombaellenes hatását az illóolaj C1 " " „" 1mum zeylanic11m --CANELA M ON CandEluJa u/bISJa TIS> fISCuJa u/bIStI A l'oii.: 6r. Ol.lNl) A HU A RACHA YUCRA l'ara Ol'TAll: L TiTUW PMOFTSIONAI, TŐL: LICF.NOADO BIOLÓKIÁBAN APM0BAD0 JURY REVISOM CONFOK AOO BY: PRESIDLJriTE D.SC. DANTF. JONI CHOQUEHUANCA PANCU.S PRJMER MIF.MBRO SEGUNl> O WED.1 \ 1.BRO IGAZGATÓ I ASF.SOR Ftt - "tad6e: 02 df'mplif'mbn: dri 2019 Terület: Cicn. Il, s Btomtdica.s Subject: Bio «x: oologia. Vegclal
3 Áldozás a Mindenható Istennek, amiért lényemet és bölcsességet adott nekem; Mindig segített abban, hogy előre lépjek, mindenkor. Különösen a legnehezebbekben. Ezt a munkát drága szüleimnek, Angel Flavio Huaracha Quispe-nak és Fidela Simona Yucra Cutipának ajánlom feltétel nélküli segítségükért, támogatásukért és motivációjukért, hogy továbblépjek és teljesítsem céljaimat. Minden családomnak, akik támogattak és mindig bíztak bennem, biztató szavaikkal és mosolyukkal motiváltak a folytatásra.
4 KÖSZÖNÖM az Altiplano de Puno Nemzeti Egyetemnek, hogy lehetőséget biztosított számomra jövőm alakítására, különös tekintettel a biológia szakmai karrierjére és az oktató személyzetre a szakmai továbbképzés során elért ismereteikért. Külön köszönetemet fejezem ki a Manuel Núñez Butrón Kórház - Puno kórtani és klinikai laboratóriumi osztályának minden munkatársának, amiért lehetővé tették számomra, hogy ebben az intézményben végezhessem kutatómunkámat, mivel segítségükkel és közreműködésükkel segítettek további ismeretek bővítésében szakdolgozatom kivitelezésében.
5 ÁLTALÁNOS TÁRGY MUTATÓ. 5 AZ ÁBRÁK MUTATÓJA. 7 A TÁBLÁZATOK MUTATÓJA A KÖVETKEZŐK MUTATÓJA ÖSSZEFOGLALÓ I. BEVEZETÉS Általános cél Egyedi célok II. AZ IRODALOM ÁTTEKINTÉSE ELMÉLETI KERET Gyógynövények Illóolajok Olajok használata Illóolaj-extrakciós technikák Cinnamomum zeylanicum Opportunisztikus mycosis Candida albicans Klinikai megnyilvánulások Laboratóriumi diagnózis Kezelés III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Tanulmányi terület A tanulmány típusa Populáció és minta Kutatásterv. 38
6 3.5. Módszertan a. Statisztikai elemzés IV. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS V. KÖVETKEZTETÉSEK VI. AJÁNLÁSOK VII. HIVATKOZÁSOK VIII. MELLÉKLETEK. 66
9 26. ábra. Pozitív kontroll (flukonazol). A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és február között.,
11 AKRONIMMÁK MUTATÓJA HMNB WHO CMI Kórház Manuel Núñez Butrón Egészségügyi Világszervezet Minimális gátló koncentráció µl mikroliter mm CMF milliméter Minimális gomba koncentráció µg mikrogramm ml cm milliliter centiméter µm mikrométer C fok Celsius ECM KOH ASD Hydroum Dkg Matrica Dkg Matrica Dkg Matrica Dkg Kilogramm CFU Extrac Gyarmatképző egységek
16 1.1. Általános cél A cinnamomum zeylanicum illóolaj Candida albicans gombaellenes hatásának értékelése in vitro. Specifikus célok A Cinnamomun zeylanicum illóolaj és a Candida albicans antibiotikum flukonazol antibiotikumának legjobb gátló koncentrációjának in vitro gátló hatásának összehasonlítása. Határozza meg a Cinnamomum zeylanicum fahéj illóolaj minimális gátló koncentrációját (MIC) 25%, 50%, 75% és 100% koncentrációban Candida albicans-on. Hipotézis A Cinnamomum zeylanicum fahéj illóolaja in vitro gátló hatást mutat a Candida albicans törzseken. Meg lehet határozni a fahéj illóolaj minimális gátló koncentrációját (MIC) 25%, 50%, 75%, 100% koncentrációban. 16.
24 Párlás macerálás után Ezt a módszert használják az olaj kivonására hagymagumókból, mandula magvakból, fokhagymagumókból és nyírfa levelekből. Másrészt az aromás növényeket forró vízzel macerációs eljárásnak kell alávetni az olaj szétválasztásának elősegítése érdekében, mivel illékony vegyületei glikozilezett komponensekhez kapcsolódnak (Albarracín & Gallo, 2003). 2. ábra: Víz-gőz desztilláció vagy nedves gőz (Vidal, 2015) Cinnamomum zeylanicum A fahéj a Lauraceae családba tartozik, a Cinnamomum nemzetségbe tartozik, amelynek körülbelül 250 faja van, a három legfontosabb fajta, amelyből a fahéjolajat kivonják, a C. zeylanicum, C. cassia Blume és C. camphora L (Sanchez, 2013). A fahéjnak biológiai hatása van, például fájdalomcsillapító, antiszeptikus, görcsoldó, afrodiziákum, összehúzó, karminatív, vérzéscsillapító, rovarölő és parazitaölő (González, 2010). Szinonimia Köznév: Ceiloni fahéj, fahéj, cannelloni (Aizaga, 2017). Német: zimt angol: fahéj olasz: cannella katalán: canyella baszk: kanelondo Galo: caneleiro 24
26 A Srí Lanka-i fahéj az európaiak kedvence, mivel lágyabb, édes ízű és drágább (Revelation, 2017). Rendszertani besorolás Királyság: Plantae osztály: Magnoliophyta Osztály: Magnoliopsida Rend: Laurales Család: Lauraceae Nemzetség: Cinnamomum Faj: Cinnamomum. zeylanicum Közönséges név: Fahéj Forrás: (Aizaga, 2017) A fahéjolaj kémiai összetétele A fahéjolaj kémiai összetételének említésekor utalunk azokra az alkotóelemekre, amelyeket a fahéj kérge jelent (aizaga, 2017), ahol a kémiai anyagok mennyisége leginkább megfelel fahéj-aldehidnek, eugenolnak, phelandrennek, linaloolnak, benzaldehidnek, kariofillénnek, benzoesavnak és benzil-cinnamátnak ((Luis, 2017), megemlíthetünk olyan anyagokat is, amelyek kisebb mennyiségben vannak jelen, mint például: tannin, kumarin, cukor és gyanta keményítő, nyálka, csersav, ásványi anyagok és flavonoidok, ezek közül az egyik a gombaellenes hatás elérésének felel meg (padrón, 2010) 1. táblázat: A fahéj összetevői Forrás: (Sanchez, 2013; (Brand, 2013) 26
Kémiai felépítés A fahéj egyes összetevőinek szerkezete (Cava, 2013) Cinnamaldehid Euglenol Catechin Pocyanidin Safrole Hatásmechanizmus A fahéjolaj működésének módja a sejtpusztulást okozó apoptózis indukciójában van, ezért ez folyamat által nekrózist generál. amellyel az élesztősejtek mitokondriális működését megzavarják, amihez ez növeli az áteresztőképességet és az ionok eltávolítását az érzékeny gombasejt membránjából. A fahéjról kimutatták, hogy citotoxikus aktivitást mutat a különböző rákos sejtekben ((Aizaga, 2017). Az indukciós hatás az expozíció után akár 24 órán keresztül is fennáll. Az élesztőt jobban befolyásolja, mint a baktériumokat; anélkül azonban, hogy ha hatását szembeállítanánk a egyéb olajok, a fahéj nagyobb gombaellenes aktivitással rendelkezik (Sanchez & Luján, 2013)
A 31 citoplazma 200-300 mm vastag hornyokkal rendelkezik, ahol 2 szteroidokat és fehérjét tartalmazó rekesz található, emellett a sejtek áteresztőképességét és a sejtfal szintézisét szabályozzák, nagyon fontos, mivel az ellensúlyozására használt gyógyszerek (antibiotikumok és gombaellenes szerek), azon a szinten járnak el. Emellett olyan enzimeket is tartalmaz, amelyek felelősek a sejtfal szintetizálásáért, ezért amikor a gyógyszer a citoplazmatikus membránra hat, automatikusan csökkenti a sejtfal szintézisét (Aguilar, 2016). A gomba sejtfala. A mannan elemek, a glükánok, a kitin és a fehérje elemek átfedése látható. A mannannal komplexeket képző fehérjék (mannoproteinek) túlmutatnak a sejtfalon. 3. ábra: Az élesztőgomba sejtfala a mannan elemek, glükánok, kitin és fehérje elemek egymásra helyezését mutatja. Forrás: Mikrobiológia (Ryan, 2012). 31
33 2. Felületi fertőzés: Ebben a szakaszban fontos a hám behatolása a gazdafehérjék hidrolitikus enzimek általi lebontása és a hifális képződés révén. 3. Mély fertőzés: szöveti behatolás, vaszkuláris invázió és immunkijátszás hidrolitikus enzimek révén, valamint a hifák képződése is szerepet játszik. 4. Disszeminált fertőzés: A Candida albicans az endotheliumhoz való tapadás, a gazda szövetek fertőzése, a koagulációs rendszer aktiválása adhezinek, hidrolitikus enzimek, ismét hifák képződésével és a fenotípus megváltoztatásával történik. In vitro vizsgálatok állatokon és embereken olyan proteázokat vontak be, mint (De la Calle és mtsai, 2012): 4. ábra: Candida albicans fertőzés szakaszai és az egyes szakaszokban résztvevő virulencia mechanizmusok (De la Calle és mtsai. 2012). 33
37 III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Tanulmányi terület A fahéj kéregmintákat a Jr. Lima N 231-től szereztük be Juliaca városában, a Santa Bárbara piac közelében reggel a fűszerek részlegben. A Cinnamomum zeylanicum fahéj esszenciális olajának megszerzésére az Altiplano Nemzeti Egyetem Agráripar Mérnöki Szakképző Iskolájának Gyümölcs- és Zöldséglaboratórium műhelyében került sor. A Candida albicans törzset a Manuel Núñez Butrón Puno regionális kórházból nyertük. A Cinnamomum zeylanicum fahéj illóolajának Candida albicans törzsekre gyakorolt gombaellenes hatását Puno városának mikrobiológiai területén, a Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálatában végezték (6. ábra). 6. ábra: A fahéj illóolaj kivonásának területe és a vizsgálat végrehajtása (Manuel Núñez Butrón Kórház) Puno, 2018. november és február között
39 2. táblázat: A Cinnamomun zeylanicum illóolaj és a flukonazol antibiotikum legjobb gátló koncentrációjának in vitro gátló hatása a Candida albicans-on. A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház mikrobiológiai körzetének Klinikai Patológiai Szolgálata 2018. november és február között. A gombaellenes aktivitás meghatározásához 30 kísérleti egységgel dolgoztunk, amelyek 5 ismétlésből álltak minden alkalmazott dózis mellett, pozitív kontroll mellett. a kereskedelemben kapható flukonazolt és negatív kontroll alkoholt használtuk Candida albicans esetében. Olyan módon, hogy a gátló hatás ellentétét szolgálták, mivel már ismert, hogy az említett mikroorganizmusok érzékenyek ezekre az antibiotikumokra. 3. táblázat: A kísérlet megtervezése, koncentrációk és ismétlések száma a minimális gátló koncentráció (MIC) meghatározásához. 39
47 Farland (16. ábra), az elkészített inokulumot csíkos tamponnal vetettük a Saboraud Dextrose Agar plusz fahéj illóolaj tartalmú lemezekre, amelyeket különböző koncentrációban vagy 100% -os fahéjolaj-adagokban készítettek, 75%, 50%, 25 %, 12,5%, 6,25% és 3,125%, párhuzamosan egy kontroll lemezt tettünk olajkoncentráció nélkül kezelés nélkül (növekedésszabályozás). Az inkubálást 24 órán át folytattuk, inkubálás után a lemezek fejlődését megvizsgáltuk annak bemutatására, hogy a Candida albicans mely minimális gátló koncentrációra (MIC) mutatott érzékenységet. Statisztikai teszteket nem használtunk. 47
56 V. KÖVETKEZTETÉSEK A fahéj illóolaj legjobb in vitro gátló hatása a Cinnamomun zeylanicum 100% -os koncentrációban (T4 kezelés), mm gátlási halo-val érhető el, ami statisztikailag szignifikáns különbséget mutat a többi alacsonyabb koncentrációjú kezeléshez képest. Hasonlóképpen, ez nem mutat statisztikailag szignifikáns különbséget az antimikotikus flukonazollal végzett kontrollhoz képest, amely mm gátlási halot eredményezett. A Cinnamomum zeylanicum fahéj illóolaj minimális gátló koncentrációjához (MIC) 25%, 50%, 75% és 100% koncentrációban a Candida albicans esetében. A fahéj illóolaj 25% -a, ez lenne a legalacsonyabb koncentráció, amellyel a gátló hatás már jelentkezik, mivel a gomba növekedése nem figyelhető meg. 56
57 VI. AJÁNLÁSOK Végezzen kutatást a Cinnamomun zeylanicum fahéj illóolajának gombaellenes hatásának igazolására a terápiás szempontból különböző gyógyszerekkel szemben, a Candidiasis okozta állapotok kezelésében. Folytassa a fahéj (Cinnamomum zeylanicum) illóolajának tanulmányozását, a Candida albicans szaporodása elleni gombaellenes hatása miatt, betegekkel végzett vizsgálatokkal; in vivo vizsgálat. Folytassa a különféle növények illóolajaiban található gombaellenes termékek vizsgálatát azzal a céllal, hogy elősegítse a természetes termékeken alapuló kezelések vizsgálatát. Készítsen különféle gyógyszerformákat a beadás módja szerint a Cinnamomun zeylanicum (fahéj) illóolaj felhasználásával a Candida albicans dermatosisban szenvedő betegek klinikai vizsgálataihoz. Végezzen további vizsgálatokat a fahéj illóolajáról annak érdekében, hogy későbbi klinikai tevékenység során lehetséges kezelésként felhasználható legyen. 57
66 A. MELLÉKLET VIII. MELLÉKLETEK 8. ábra: Juliaca városában megszerzett Cinnamomum zeilanicum (fahéj) kérge, november 9. ábra Fahéj kéreg mérése. Gyümölcs és zöldség műhely laboratórium, november 11. ábra. Fahéj kéreg őrlése a gyümölcs és zöldség műhely laboratóriumban, november 10. ábra. A fahéj illóolajának kivonása a vízgőz bevezetésének módszerével. A gyümölcs- és zöldségméretek laborjában, november
67 12. ábra: Fahéjolaj dekantálása a Taller de Frutas y Vortalizas laboratóriumában, 2018. november 13. ábra: Fahéj illóolaj beszerzése a Taller de Frutas y Vegetables laboratóriumában, 2018. november 14. ábra: Olajkoncentráció esszenciális fahéj 100 %, 75%, 50%, 25%, pozitív kontroll (flukonazol) és negatív kontroll (alkohol), a Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, mikrobiológiai terület, 2018. november és 2019. február. 15. ábra: Candida albicans izolálása törzsek, a Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, mikrobiológiai terület, 2018. november - február,
68 16. ábra: Mc Farland skála elkészítése. A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és február között, 17. ábra. Candida albicans megfigyelése 40x-en, a Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház, Mikrobiológiai Terület klinikai patológiai szolgálata a hónapokban 2018. novembertől februárig,
69 18. ábra: Mintafeldolgozás csíracsövek módszeréhez, a Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház, Mikrobiológiai Körzet Klinikai Patológiai Szolgálata, 2018. november és 2019 február között. 19. ábra: Mikroszkóp megfigyelés 40 x-nél Candida albicans esetében, Klinikai Pathology Service a Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház mikrobiológiai területén, 2018. november és február között,
70 20. ábra: A gátlás halogénje 50% -os koncentrációban. A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és február között, 21. ábra. Halo gátlás 75% -os koncentrációban. A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és február között.,
71 22. ábra: Gátlás halogénje 100% -os koncentrációnál. A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és 2019 február között. 23. ábra: Candida albicans törzsek beoltása Saboraud Dextrose Agar-ban. A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és február között.,
72 24. ábra: A gátlás halogénje 25% -os koncentrációban. A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és 2019 február között. 25. ábra Negatív kontroll (alkohol). A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és február között.,
73 26. ábra. Pozitív kontroll (flukonazol). A Manuel Núñez Butrón Regionális Kórház klinikai patológiai szolgálata, a mikrobiológiai terület, 2018. november és február között.,