2011. január 3, hétfő
Élesztő osztályozási módszerek
AZ ÉGET OSZTÁLYOZÁSÁBAN HASZNÁLT JELLEMZŐK
- A sejtek mikroszkópos megjelenése.
- Szexuális reprodukciós mód.
- Fiziológiai jellemzők (különösen táplálkozási).
- Biokémiai jellemzők.
- A genomok összehasonlítása DNS-DNS vagy DNS-RNS újraszociációval
Rendszertan: Osztályozási és azonosítási tanulmány.
Osztályozás: Az élőlények csoportosítása taxonokba (taxonokba) az ősi hasonlóságok vagy kapcsolatok, vagy mindkettő szerint.
Azonosítás: Ismeretlen és hasonló ismert törzs összehasonlítása.
Nómenklatúra: Az elfogadott taxonok neve.
MIKROSZKÓPOS SZEMPONT
Sejtméret.
Alak: A sejtek alakja a vegetatív szaporodás módját jelzi.
Szálképződés
Szexuális szaporodás Az aszkospórák és a teliospórák szerkezete és alakja
FIZIOLÓGIAI JELLEMZŐK
Bizonyos cukrok erjesztésének képessége (fermentációs teszt).
Aerob növekedés különféle vegyületekkel (asszimilációs tesztek), amelyek mindegyike egyedüli szén- vagy nitrogénforrás.
Arbutin hasadás.
TECHNOLÓGIAI JELLEMZŐK
A fermentációs képesség vizsgálata.
A taxonómiai vizsgálatok inkubációs hőmérséklete 25º C, bár egyes élesztőknél az optimális magasabb, másoknál alacsonyabb.
KELET-OSZTÁLYOZÁSI MÓDSZEREK
Módszer: A sporulációt az élesztők kedvező, glükózban gazdag táptalajban (előporzó közegben) történő tenyésztése okozza, amelyben 48 órán át 28 ° C-on maradnak. Ez idő után a glükózban szegény sporulációs táptalajba (sporifikációs közegbe) vetik a vegetatív szaporodás lehető legnagyobb mértékű csökkentése érdekében, és kiegészítik sporulációt kiváltó anyaggal, például acetáttal. Ebben az utolsó közegben 3-5 napig 25 ° C hőmérsékleten tartják őket. Ezen inkubációs periódus után friss készítményeket készítenek, majd mikroszkópos megfigyelést végeznek, figyelembe véve a spórák jelenlétét vagy hiányát, valamint méretüket. A megfigyelés megkönnyítése érdekében kétes esetekben spórafestést lehet végezni.
Negatív sporuláció esetén a tenyészeteket szobahőmérsékleten tartják, és hetente legalább 4-6 hétig vizsgálják.
A média összetétele:
Előtermékenyítő közeg
50 g glükóz
Élesztőkivonat 10 g
Tápanyag-húsleves (Difco) 30 g
Kálium-acetát
Agar 20 g
1000 ml víz
Sporifikációs közeg:
1 g glükóz
2,5 g élesztő kivonat
Tápanyag-húsleves (Difco)
9,8 g kálium-acetát
Agar 20 g
1000 ml víz
A csövezés előtt a közeget meg kell olvasztani, mivel agart tartalmaz.
A táptalaj sterilizálását autoklávban, egy atmoszférában végezzük 15 percig.
A fermentációs teljesítmény az etanol százalékos (V/V) mértéke, amelyet egy élesztő törzs képes előállítani.
Ezt a tesztet eredetileg Hayduck dolgozta ki, és Hericstoth és Osztrovsky írta le 1927-ben. Az alkoholos erjesztés során felszabaduló szén-dioxid súlycsökkenésen alapuló meghatározásán alapul a sztöchiometrikus egyenlet szerint:
C2H12 06 ——-———— 2 CO2 + 2 CH3-CH2OH
Módszer: Az erjesztési teljesítmény meghatározásához 12º Beaumé szőlőmustot készítünk koncentrált mustból, pH-értékét nátrium-hidroxiddal vagy sósavoldattal 5-re állítva.
Az így készített táptalajt 100 ml-es Erlenmeyer-lombikokba osztjuk. 50 ml tápoldatot teszünk mindegyikbe. Autoklávban 121 ° C-on 15 percig sterilizáljuk.
A vetés fiatal kultúrákból származó platina fogantyúval történik - a must elvetése után a lombikokat Müller-szelepekkel ellátott tömény kénsavval ellátott gumidugókkal zárják le. Ezek a szelepek lehetővé teszik a szén-dioxid kilépését és megakadályozzák a levegő bejutását.
A vetés után a lombikokat lemérjük és 25 ° C-on inkubáljuk. állandó súlyig.
A folyamat végén keletkező súlykülönbség a felszabaduló szén-dioxidot jelzi, amelyet megszorozva egy megállapított tényezővel, közvetlenül megkapja a képződött etanol százalékos értékét (V/V).
Faktorszámítás:
180 g glükóz fermentálásakor 88 g szén-dioxidot és 92 etanolt termelnek; ezért egy gramm CO2 megfelel 1,04 g etanolnak. Mivel az etanol sűrűsége 0,79, 1,04 g megfelel 1,3 ce térfogatnak, ezért 1 g CO2 megfelel 1,3 ce etanolnak.
A grammban kifejezett tömegkülönbség szorzata 1,3-mal megkapja az előállított etanol térfogatát.
Sörlétérfogat ————————— 1,3-szoros fogyás = g etanol
100 ———————————————— PF
A sör térfogata 50 ml volt. hamar:
PF = 100 x 1,3 x súlycsökkenés grammban: 50
P.F. = 2,6 x súlycsökkenés grammban.
A gyakorlatban ezt megszorozzák 2,5-vel, mivel a hozam nem 100.
Ennek a tesztnek az eredménye fontos információt nyújt a vizsgált törzs azonosságáról.
A taxonómusok nem veszik figyelembe ezt a tesztet, azonban az Ipari Fermentációs Intézetben megfigyelték, hogy ez a teszt gyorsan meghatározza a nemzetséget, és azon belül, egyes esetekben a Saccharomyces nemzetségnél lehetővé teszi a különféle fajok megkülönböztetését. Ennek a tesztnek a mellőzése annak a ténynek tudható be, hogy a szőlőmust nem elsősorban az élesztő vizsgálatának forrása, ahogy ez az Intézetben szinte annak eredetétől fogva megtörtént.
A PSEUDOMICELIÁRI ÁGAK ALAKULÁSA
Módszer: Abszorbens papírt helyezünk egy Petri-csészébe, és egy hajlított üvegrudat helyezünk a tetejére, amelyre csúszdát helyezünk. A készletet 120 ° C hőmérsékletű kemencében 3 órán át sterilizáljuk. Miután steril és aszeptikus körülmények között dolgozott, néhány csepp steril olvasztott maláta agart viszünk fel a tárgylemezre, hogy vékony filmet képezzünk. Amikor a táptalaj szilárd, egy fiatal tenyészetből (48 órán át malátagaron) vetjük platina huzallal, hosszanti csíkot és számos nagyon könnyű keresztirányú vonalat alkotva. Steril vizet öntünk a papírra a magas páratartalom fenntartása érdekében a lemez belsejében.
A lehetséges elágazások közvetlen megfigyeléssel mikroszkóp alatt detektálhatók, miután a vetés után 15 és 30 nappal inkubáltuk 25 ° C-on. Láthatók olyan formációk, mint a klamidoszpórák, a blasztoszpórák és az artroszpórák. Ennek a tesztnek a jelentősége nagyobb azoknál a törzseknél, amelyek nem mutatnak spórát.
A blasztoszpórák alakjától és elrendezésétől függően a pseudomycelium többféle típusa különböztethető meg:
- Mycandid típus. Kerek vagy hosszúkás blasztospórákkal, többé-kevésbé elágazókkal.
- Mycotorula típus. Kerek blasztoszpórákkal és tengelyirányú elrendezéssel az örvényekben, hasonlítva a kerek sejtek csomóihoz.
- Blastodendrium típus. Hosszúkás és elágazó blasztospórákkal az örvényekben.
A GYŰJTEMÉNY ALAKULÁSA
Számos élesztőfajban megjelenik a fátyol kialakításának folyékony közegen való tulajdonsága.
Bár úgy tűnik, hogy a fátyolozás szorosan kapcsolódik az élesztő oxigénigényéhez, a fermentációs élesztők ugyanúgy fátyolosodhatnak, mint a nem fermentatív élesztők. Bár kialakulásában fontosak olyan tényezők, mint a táptalaj összetétele, a tartály formája, életkor, az oltóanyag mennyisége.
Ennek a tesztnek a taxonómiai értéke nem fontos, de még egy információt tartalmaz a faj jellemzésében.
Módszer: A fátyolképződés vizsgálatához az élesztőt 8 ° Baume szőlőmustba vetik.
A 8 ° -os Baumé szőlőmustot jó minőségű, vagy friss szőlőből nyert sűrített szőlőmust desztillált vízben történő hígításával készítik. Forraljuk fel és forrón szűrjük le egy szirupszűrővel, majd állítsuk a pH-t 5-re. Hagyjuk lehűlni, és szűrjük át egy szirupszűrőn.
10 ml-t adagolunk a 16 x 160 mm-es kémcsövekbe.
Ismét sterilizáljuk az autoklávban, fél atmoszférában 30 percig. Ily módon tiszta és steril mustunk van, előkészítve a vetésre.
Az említett vetést úgy végezzük, hogy az egyes fiatal tenyészetek 48 órás ciklusát egy cső szőlőmustba vezetjük, ezt a műveletet két példányban hajtjuk végre.
Az oltott táptalajt egy hónapig 21 ° C ± 1 hőmérsékleten tartjuk.
Az első megfigyelést két nappal a vetés után végezzük.
Az eredményeket a következőképpen rögzítjük:
Fátyol jelenléte V jelzéssel.
Az I. jelű szigetek jelenléte.
A jelű gyűrű jelenléte.
Fátyol hiánya a VN jelzéssel.
Az S jel olyan esetekre van fenntartva, amikor az élesztő üledék látható a mustban, és a T jel, amelyeknél erős zavarosság és buborékok szabadulnak fel.
CUKOROK FERMENTÁLÁSA
Az élesztő cukrok erjesztésére való képességét a vizsgált törzsek tenyésztésével vizsgáljuk a vizsgálandó cukrok folyékony oldataiban.
A felhasznált közeg összetétele a következő:
Bacto-élesztő-nitrogén-bázis (Difco) 6,7 g
Vizsgálati cukor 20 g
1000 ml desztillált víz
Módszer: Az elkészített táptalajt kémcsövekben 9 ml-es sebességgel osztjuk el, Durham-burkolattal ellátva; és autoklávban sterilizáljuk 121 ° C-on (egy atmoszférában) 15 percig. A vetést fiatal tenyészetekről hajtják végre (48 órán át agarmaltán), ezeket 28 napos kemencében 15 napig inkubálják. A teszt akkor tekinthető pozitívnak, ha inkubálás után gáz jelenik meg a burkolatban.
A vizsgált cukrok: glükóz, galaktóz, maltóz, szacharóz, laktóz és raffinóz.
A raffinóz esete külön figyelmet érdemel. A cukor fermentációjában pozitív eredményt nyújtó törzseknek megfelelő táptalajt papírkromatográfiának vetjük alá, hogy kiderítsük, melyik az a vegyület, amely a raffinóz lebomlása után szabad marad a közegben.
A kromatográfia után három eset lehet:
- A melibióz vagy szacharóz szabadon marad. Fermentáció 1/3
- A galaktóz szabad marad fermentáció 2/3
- Nem jelenik meg semmilyen cukor nyoma Fermentáció 3/3
A CUKOROK ELLENŐRZÉSE
A cukrok asszimilálása abból áll, hogy meghatározzuk azokat a cukrokat, amelyeket a vizsgált élesztő törzsek oxidatív úton képesek metabolizálni. Mivel az összes fermentált cukor is asszimilálódik, ezt a vizsgálatot csak azoknál a cukroknál kell elvégezni, amelyekhez a törzs nem fermentálódott.
A felhasznált közeg összetétele a következő:
Bacto-élesztő-nitrogén-bázis (Difco) 6,7 g
Vizsgálati cukor 1 g
Agar 20 g
1000 ml desztillált víz
A vetés egy fiatal tenyészetből indul ki (48 óra malátagar-ban), fiziológiás szérumban szuszpendálva. Ennek a szuszpenziónak a tartalmát a csövekbe öntjük a vizsgált cukrok ferde eszközével oly módon, hogy a közeg teljes felületét impregnáljuk az oltóanyaggal, majd a felesleges szuszpenziót eldobjuk. Az ilyen módon beoltott csöveket 15 napig 28 ° C-on inkubáljuk, ezután a táptalaj felületén a növekedés pozitív válaszra utal, míg hiánya negatívnak tekinthető.
A teszt elvégzésének másik módja az auxonográfiai módszer alkalmazása. Ezt a módszert lemezeken hajtják végre, és mindegyikben egyszerre lehet tesztelni a különféle cukrokat.
A felhasznált közeg:
Bacto-élesztő-nitrogén-bázis (Difco) 6,7 g
Agar 20 g
1000 ml desztillált víz
15 percig 121 ° C-os autoklávban sterilizáljuk, majd hagyjuk 45 ° C-ra hűlni és elosztjuk a lemezeken, amelyeken a vizsgálandó törzsek szuszpenzióját korábban fiziológiai oldatba helyeztük, majd homogenizálás céljából megkevertük. hagyjuk megszilárdulni. A vizsgálandó cukrok steril oldatával impregnált abszorbens papírkorongokat desztillált vízben 2% -ra helyezzük az oltott táptalajra. A lemezeket 28 ° C-on inkubáljuk 3-4 napig, majd figyeljük meg, hogy növekedési halók történtek-e, ebben az esetben a tesztet pozitívnak tekintjük.
NITRÁTOK HASZNÁLATA
Ez a teszt az élesztők nitrogénforrásként aerob módon történő felhasználásának tesztje.
A tesztben használt két közeg összetétele a következő:
1. közeg
Élesztő-szénalap (Difco) 11,7 g
0,78 g kálium-nitrát
Agar 20 g
1000 ml desztillált víz
2. közeg
Élesztő-szénalap (Difco) 11,7 g
Agar 20 g
1000 ml desztillált víz
Módszer: A vetés mindkét esetben indirekt módszerrel történik, egy fiatal tenyészettől kezdve (48 óra agarmalta), fiziológiás szérumban szuszpendálva. Ennek a szuszpenziónak a tartalmát a vizsgált ferde közeggel a csövekre öntjük oly módon, hogy a közeg teljes felületét impregnáljuk az oltóanyaggal, hogy később a felesleges szuszpenziót eldobjuk. Miután beoltottuk, a csöveket 15 napig inkubáltuk 28 ° C-on. Ezen idő elteltével összehasonlítjuk az ugyanazon mikroorganizmushoz tartozó tenyészetek mindegyikét, megfigyelve, hogy a kálium-nitrát jelenléte elősegítette-e a vetett törzs növekedését. Abban az esetben, ha a nitráttartalmú közegben nagyobb a növekedés, mint annak hiányában, az eredmény pozitívnak tekinthető. Ha nincs különbség, akkor negatívnak kell tekinteni, mivel a nitrát hatását nullának tekintik.
AZ ARBUTIN KIVÉTELE
Az arbutin lebontása a ß-glükozidáz aktivitás megerősítő tesztje élesztő törzsekben.
A felhasznált közeg összetétele a következő:
Arbutin 5 g
Élesztő kivonat 1 g
Agar 20 g
1000 ml desztillált víz
Módszer: Miután a táptalajt vízfürdőben feloldottuk, kémcsövekben osztottuk el, amelyekhez korábban egy csepp oldható vas-sót (1% vas-klorid desztillált vízben) adtunk. 15 percig 121 ° C-os autoklávban sterilizáljuk, majd megdönthetjük, hogy megszilárduljon.
A vetést fiatal tenyészetekből származó sztria hajtja végre, 28 ° C-os kemencében 15 napig inkubálva. Kényelmes egy mag nélküli csövet ugyanolyan körülmények között hagyni, hogy kontrollként működjön.
A teszt akkor tekinthető pozitívnak, ha az élesztő növekedése után színváltozás figyelhető meg a kontrollcsőhöz képest, mivel azokban az esetekben, amikor az arbutin hidrolizálódik, szabad kinon képződik, amely az oldatban lévő oldható vas-sóval reagálva a táptalaj sötétbarna színt ad.
Ezek molekuláris technikák, amelyek a nukleinsavmolekulák fragmenseinek elemzésén alapulnak, a leggyakrabban alkalmazott kariotípus-elektroforézis, mikroszatellit-elemzés, a mitokondriális DNS hosszpolimorfizmusa, a riboszomális RNS restrikciós fragmenseinek hosszanti polimorfizmusa, a véletlenszerűen amplifikált DNS polimorfizmusa és az alacsony molekulatömegű RNS.
Az élesztő és általában a mikroorganizmusok azonosítására szolgáló molekuláris módszerek a DNS és RNS molekulák vizsgálatán alapulnak.