szakértő

Molekuláris biológia, fehérjék

Öt gyakorlati tipp a Western Blot-szakértővé váláshoz

A Western blot (WB) továbbra is a legszélesebb körben alkalmazott módszer a fehérjék szétválasztására és kimutatására, és ennek ellenére még mindig unalmas, hogy finomítani kell az egyes kísérleteket. Kísérletünk optimalizálása kulcsfontosságú, és az olyan tényezők, mint: az antitest minősége, a blokkoló pufferek vagy az átvitel hatékonysága kulcsfontosságú lépés a siker érdekében.

Részletesen elemezzük, hogy milyen tippek és eszközök segítségével javíthatunk eredményeinken.

1. Töltse be a megfelelő mennyiségű fehérjét

Az egyes üregekbe töltendő fehérje mennyisége változó és a kutatónak optimalizálnia kell, mivel ez egy tényező, amely függ a kifejezési szintek annak a génnek a szövetében. Ezenkívül figyelembe kell venni, hogy mely minta térfogata beismeri az a csésze. Között azonban 10. Y 50 ug fehérje szövethomogenátumból és között 10. Y 100 ng a tisztított minták összes fehérje általában elegendő.

2. Szükséges-e a mintáim csökkentése vagy denaturálása?

Az antitest műszaki adatlapjának áttekintése elengedhetetlen ahhoz, hogy tudjuk, hogyan kell elkészíteni a mintáinkat. Jellemzően a WB mintái fehérjék denaturált. A natív fehérjék harmadlagos szerkezettel rendelkeznek, és konformációjuk alapvető szerepet tölt be a fehérjékben funkció fehérje. Ez a szerkezet azonban hatással lesz a migráció ezeknek a fehérjéknek a pórusok poliakrilamid. A fehérje denaturációja a következő módon végezhető el:

  • Nátrium-dodecil-szulfát (SDS) egy detergens, amelyet a hidrogénkötések lebontására és a harmadlagos szerkezet szétbontására használnak.
  • Redukálószerek, mint pl b-merkaptoetanol vagy ditiotreitol (DTT) a ciszteinek közötti diszulfidhidak csökkentésére.
  • Hő a mintákat 100 ° C az SDS denaturálásához és megkönnyítéséhez.


3. Hogyan lehet elkerülni a rettegett "mosolygós" bandákat és a "foltokat"? ?

Ha membránunk bemutatja ezeket a „mosolygósávokat”, valószínűleg az elektroforézist el kellett volna végezni túl gyors vagy a minták túl forrók lettek. Még egy migráció ajánlott lassú alatt több időt és ha lehetséges, ben hideg.

Néha megjelennek foltok fehér a blotunkban ennek eredményeként buborékok az átadási folyamat során csapdába esett levegő. Ennek a bosszantó problémának az elkerülése érdekében javasoljuk egy 50 ml-es kúpos cső használatát a transzferkészleten azzal a gondolattal, hogy megszabadul a poliakrilamid-gél és a nitrocellulóz- vagy PVDF-membrán közötti maradék levegő.

4. Van-e különbség a BSA-val vagy tejjel történő blokkolás között?

Miután a fehérjét a poliakrilamid gélről a membránra helyezte alapvető annak érdekében blokkolja a membrán azon pontjait, amelyek nem tartalmaznak ligandumot csökkenteni az antitest membránhoz való háttér vagy nem specifikus kötődése.

Számunkra ez több javasolható kövesse a gyártó által megadott tanácsokat, mivel általában az antitestek nagyon érzékeny az alkalmazott blokkolószer típusa.

Általában a szarvasmarha szérum albuminnal történő blokkolás (BSA) egyértelműbb eredményeket nyújt, mivel ennek a fehérjének a keresztreaktivitása alacsonyabb. Ezenkívül a BSA alkalmazását azokban a blotokban jelzik, amelyekben fehérjéket akarunk kimutatni foszforilezett.

Számos antitest azonban jobban működik együtt tej sovány, mivel sokféle blokkolószert tartalmaz.

5. Milyen hígítású primer antitestet használjak?

Az antitest optimális koncentrációja az, amellyel jó jelet kapunk minimális háttérzaj mellett. Nyilvánvaló, hogy a megtakarítás érdekében ideális az antitestünket hígítani, amíg a jel megfelelő.

Új antitestekkel azonban célszerű hígító bankot készíteni annak ismerete érdekében, hogy melyik hígítás a legjobban alkalmazkodik a szövet ezen fehérjéjéhez. Például, ha a gyártó 1: 200 hígítást javasol, akkor 1:50, 1: 100, 1: 500 vagy akár 1: 1000 hígításokat is tesztelhetünk.

Abban az esetben, ha nincs további információnk az alkalmazandó hígításról, a következő paraméterek szerint tájékozódhatunk:

  • sejttenyészet felülúszója: kb. 1:10
  • ascites: 1: 100
  • teljes antiszérum: 1:50 és 1: 100 között
  • tisztított antitest: 5 ug/ml

Konzultáljon a Western blot összes megoldásával, amelyet a Labclinics kínál Önnek

Genetex a Western Blot-hoz kapcsolódó termékek széles választékát kínálja (elektroforézis, transzfer, blokkolás stb.).