Tárgyak

Ez a cikk frissült

Összegzés

Bevezetés

Az elhízás világszerte elérte a járvány mértékét, évente legalább 2,8 millió ember hal meg túlsúlya vagy elhízása következtében (WHO). Az elhízás az inzulinrezisztencia, a szív- és érrendszeri betegségek és a 2-es típusú cukorbetegség (T2D) 1 legfontosabb kockázati tényezője is. A T2D-ben szenvedő betegek általában hiperglikémiásak és olyan szövődményeket szenvednek, mint a magas vérnyomás, agyvérzés, az érelmeszesedés és a rák 2. Az elhízást csökkentő stratégiák ígéretet tesznek a halálozás csökkentésére és az érintett emberek életminőségének javítására.

Kimutattuk, hogy a bilirubin szisztémás beadása növeli az inzulinérzékenységet az ER stressz és gyulladás elnyomásán keresztül a DIO 35 egerekben. Kiterjesztettük ezeket a megfigyeléseket, és megvizsgáltuk, hogy a bilirubin szabályozza-e a lipid anyagcserét, ahogyan azt a Gilbert-kórban szenvedő betegeknél megfigyelték 34, és hogy a bilirubin szabályozza-e a szérum adipokin szintjét DIO egerekben. Kiértékeltük a bilirubin-kezelés hosszú távú hatását a lipid-anyagcserére és az adipokinszintre 7 héttel a bilirubin-kezelés befejezése után.

Eredmények

A bilirubin adagolása csökkenti a testtömeget és javítja az inzulinrezisztenciát a DIO egerekben

Teljes méretű asztal

inzulinérzékenységet

( nak nek ) DIO + BR, DIO + V és CHOW egerek májsúlya. ( b ) A mellékvese zsírsúlya DIO + BR, DIO + V és CHOW egerekből. ( c ) A vakuola terület frakciói a DIO + BR, DIO + V vagy CHOW egerek májában. ( d ) A DIO + BR, DIO + V vagy CHOW epididymális adipociták zsírbuborékjainak átmérője (µm). ( és ) A máj és zsírszövet metszetek H&E festésének reprezentatív mikrográfiái DIO + BR, DIO + V és CHOW egerekből. Méretarány = 200 μm. Legalább 3 egeret teszteltünk minden csoportban; * o

A szérum TC szintjei ( nak nek ), LDL ( b ), HDL ( c ), TG ( d ), leptin ( és ), adiponektin ( F ), Teljes bilirubin ( g ) és a közvetlen bilirubin ( h ) DIO + BR, DIO + V vagy CHOW egerekben mértük a szérumot közvetlenül a bilirubin kezelés befejezése után. Minden csoport 3-4 egeret tartalmazott; Az adatok átlag ± szórás; *** o

Az inzulinreceptor (Insr) mRNS relatív expressziója ( nak nek ), SREBP-1 ( b ), Fasn ( c ) és az ACC ( d ) a DIO + BR, DIO + V és CHOW egerek májjában, RT-PCR analízissel mérve. Az értékek a célgén relatív expresszióját képviselik az endogén kontroll expressziójához viszonyítva. ( és ) A PPARγ és C/EBPα fehérje expressziója a DIO + BR, DIO + V és CHOW egerek májában Western blot analízissel. A géleket ugyanazon kísérleti körülmények között futtattuk, és a kivágott foltokat mutatjuk be. ( F ) A PPARγ és ( g ) C/EBPα a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) kontrollhoz viszonyítva (NIH ImageJ szoftver). 3 egyedi egérből vett mintákat elemeztünk. Az adatok átlag ± szórás; *** o

( nak nek ) A DIO + BR, DIO + V és CHOW egerek testsúlya a 9 hetes kísérlet során. ( b ) Szérum glükózszint DIO + BR, DIO + V és CHOW egerekben a 9 hetes kísérlet során. Máj ( c ) és az epididymis zsírtömegét ( d ) a kezelés befejezése után 7 héttel mérve. ( és ) (balra) a kezelés befejezése után 7 héttel mért DIO egerek GTT-je; az alapvonal feletti görbe alatti terület (jobbra) értékei; ( F ) (balra) a kezelés befejezése után 7 héttel mért DIO egerek ITT-je; (jobbra) inverz területértékek az alapvonal alatti görbén. Legalább 3 egeret vettünk fel minden csoportba. Az adatok átlag ± szórás; *** o

A tanulmány legdrámaibb megállapítása az, hogy a bilirubin-kezelés csökkentette a teljes koleszterinszintet a DIO egerekben. A csökkenés oka lehet a HDL és az LDL szintjének változása, bár ezen elemek csökkenése nem érte el a statisztikai szignifikanciát. Ezek az eredmények összhangban vannak a Gilbert-szindrómában szenvedő betegek megfigyeléseivel abban, hogy az enyhén emelkedett bilirubinszint az összes koleszterin, az LDL és a triglicerid szintjének csökkenésével jár, és csökkent gyulladáscsökkentő állapothoz és csökkent expozícióhoz kapcsolódik oxidatív körülmények között. 31, 34, 37, 38, 39. Bár a bilirubinnal kezelt egereknél 14 nappal a bilirubin-kezelés után nem figyeltünk meg változást a trigliceridkoncentrációban, a kezelést követően 7 héttel csökkenést figyeltünk meg, jelezve, hogy a bilirubin trigliceridszintre gyakorolt ​​hatása késleltethető. Vizsgálatunk bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy az exogén módon beadott bilirubin az elhízott egereknél megváltozott lipidprofilhoz kapcsolódik.

Megállapítottuk, hogy a bilirubin beadása jelentősen csökkentette a leptin szintjét a DIO egerekben. A bilirubinnal kezelt DIO egerek táplálékfelvétele nem tűnt tényezőnek a bilirubin-kezelés során, és a kezelés befejezése után nem tapasztaltunk különbséget az ételfogyasztásban. A lirptinszint csökkenését a bilirubinnal kezelt egerekben a zsírszövet csökkenése okozhatja, amit az SREBP-1 csökkent expressziója is alátámaszt. Két további megfigyelés releváns: a leptinről ismert, hogy a TNF-α 40 szabályozásával fokozza a gyulladást, és a bilirubin-kezelés csökkenti a TNF-α expresszióját a DIO 35 egerekben. Ezért ésszerű azt feltételezni, hogy a bilirubin elhízásra gyakorolt ​​hatása a lipidszintézis megváltozásának, a leptinszint csökkenésének és a TNF-α termelésének csökkenésének következménye. Klinikai jelentőségű, hogy a bilirubint a lipidszintézis csökkentésének lehetséges kezeléseként kell megvizsgálni, amint azt az emberi vizsgálatok 34 javasolják .

Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy a rövid távú bilirubin-kezelés az összkoleszterinszint csökkenésével, valamint a PPARγ és az adipokinek növekedésével járt. Ezek az eredmények mechanikai bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a megváltozott bilirubin- vagy bilirubin-anyagcsere (például részleges UGT1A1-gátlók 49) terápiás megközelítésként hasznosak lehetnek az elhízás csökkentése, az inzulinrezisztencia és az inzulin tolerancia javítása érdekében.

Mód

Az állatok

A hím C57BL/6 egereket (6 hetesek) a Kínai Tudományos Akadémia Genetikai és Fejlődésbiológiai Intézetéből (Peking, Kína) vásároltuk. Az egereket magas zsírtartalmú étrenddel (1. táblázat) vagy standard CHOW diétával (a zsírból származó kalória 10% -a) táplálták 24 hétig a kezelés előtt. A Qingdao Mezőgazdasági Egyetem Állatgondozási Bizottsága minden állatkísérletet jóváhagyott. A módszereket a jóváhagyott irányelvek szerint hajtották végre.

Bilirubin előkészítése és beadása.

A bilirubint (Frontier Scientific, Logan, UT) 0,1 N NaOH-ban oldottuk, és a pH-t HCl-re 7,4-re állítottuk. A bilirubint intraperitoneálisan, 20 μmol/kg-ot (11,7 mg/kg) adták be naponta kétszer, 14 napig. A kontroll DIO vagy CHOW egerek vektort kaptak ugyanazon injekciós ütemterv szerint.

Egér monitorozás a kezelés után.

Az éhezés nélküli vércukorszintet és az egerek testtömegét naponta 9: 00-kor mértük. Az egér farka végének minimális farokmetszéséből egy csepp teljes vért (kb. 5-10 µl) gyűjtöttünk és Sannuo glükométerrel (San Nuo Inc., Changsha, Kína) elemeztünk. Az egerek fizikai aktivitását (beleértve a viselkedést, a táplálékfelvételt, az alkoholfogyasztást és a nyalást) naponta figyelték meg, a leírtak szerint 35. A táplálékfelvételt (az effúzió kivételével) 24 órán át, a kezelés után 7 nappal, hetente 7 hétig mértük a bilirubin kezelés után.

Intraperitoneális glükóz tolerancia (IPGTT) és inzulin tolerancia teszt (ITT)

Az IPGTT esetében az egereket egy éjszakán át éheztettük, majd 2 g/kg glükózoldattal (ip) injektáltuk őket. Az ITT esetében az egereket 5 órán át éheztettük, majd 0,75 E/kg inzulint injektáltunk (ip; Eli Lili, Indianapolis, IN). A szérum vércukorszintet 0, 15, 30, 60, 90 és 120 perccel mértük a glükóz vagy inzulin injekció után.

Szövetgyűjtés, szérumkészítés és vérkémia.

Minden kísérlet végén az egereket érzéstelenítettük, és retorbitális vérzéssel heparinált csőbe gyűjtöttük a vért. A plazmát centrifugálással nyertük, és későbbi elemzés céljából -80 ° C-on tároltuk. Az egereket eutanizáltuk, a mellékmáj máját és zsírszöveteit eltávolítottuk, lemértük, majd további elemzés céljából folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A TC, TG, HDL, LDL és bilirubin szérumszintjét specifikus reagenskészletek (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO) alkalmazásával mértük. A leptin, inzulin és adiponektin szintjét ELISA módszerrel mértük (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Valós idejű elemzés (RT) -PCR

Az inzulin receptor, a leptin receptor, az apolipoprotein A-IV (Apoa4) és az SREBP-1 expresszióját a májban RT-PCR analízissel számszerűsítettük, a korábban leírtak szerint [50]. A p-aktin expresszióját minden mintában RT-PCR-rel számszerűsítettük, és endogén kontrollként alkalmaztuk. A valós idejű RT-PCR primereket a Life Technologies-től (Invitrogen Trading Co., Ltd., Shanghai, Kína) vásároltuk.

Western Blot elemzés

A teljes sejtlizátumok fehérjetartalmát a BCA vizsgálattal számszerűsítettük, és mindegyik mintából 30 μg fehérjét elválasztottunk egy 4-12% -os Bis-Tris gélen (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kína). A fehérjéket egy Hybond-P membránra vittük át (GE healthcare, Piscataway, NJ), 5% zsírmentes tejjel blokkoltuk, és a következő primer antitestekkel inkubáltuk: PPARγ, C/EBPα (Abcam, USA). ÉS GAPDH (Santa Cruz). Biotechnology Inc., USA), éjszakán át 4 ° C-on. Ezután a blotokat torma-peroxidázzal jelölt másodlagos antitestekkel (Sangon Biotech Ltd., Shanghai, Kína) 45 percig szobahőmérsékleten szondáztuk, és ECL detektáló készlettel (Amersham Pharmacia Biotech) tettük láthatóvá., Little Chalfont, Egyesült Királyság). Az egyes jelek intenzitását Image J szoftver (NIH) segítségével határoztuk meg.

Hematoxilin és eozin (H&E) festés

Az egér májának és az epididymális zsírnak az immunhisztokémiáját a leírtak szerint végeztük [35]. Röviden: a máj- vagy zsírszövet-metszeteket egy éjszakán át 10% -os pufferolt formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk és metszettük. A tárgylemezeket 6 percig szűrt hematoxilinbe merítettük, vízzel leöblítettük és további 1-2 percig eozinnal festettük. A metszeteket vízzel öblítették és növekvő alkoholos oldatokban dehidratálták, xilollal öblítették és fedőlemezzel szerelték fel a címkézett üveglemezre. A tárgylemezeket Olympus BX51 kettős felhasználású transzflektív mikroszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) vizsgáltuk, és a képeket Olympus DP72 digitális fényképezőgéppel készítettük. A vakuola területét a máj teljes szöveti területén Image-Pro Plus elemző szoftver segítségével határoztuk meg a májban. Az egyes zsírsejt-átmérőket (n = 75 minden csoportban) standard CellSens szoftverrel (Olympus) mértük.

statisztikai elemzés

Az adatokat átlag ± szórásként fejezzük ki. Két csoport közötti különbségeket statisztikai szignifikancia szempontjából összehasonlítottuk nem párosított Student-féle t-tesztekkel Bonferroni korrekcióval. A különbségeket akkor tekintettük jelentősnek, amikor p