A Mycobacterium avium paratuberculosis mezei törzsét Dr. Marco Antonio Santillán adományozta a CENID Microbiology INIFAP-tól, ezt a törzset használták pozitív kontrollként a PCR-vizsgálatban.

2008 végén 139 széklet- és vérmintát gyűjtöttek 1 és 3,5 év közötti kecskékből a La Mesilla közösségben, Tecozautla községben. Ez a település Hidalgo államban található, a szélesség 20 ° 48 ', a hosszúság -99 ° 67' párhuzamok között, 1890 méteres tengerszint feletti magasságban. Ezen a területen vannak olyan vidéki termelők, akik alacsony technikai színvonalú produkcióval rendelkeznek, kevés megelőző orvosi gyakorlattal, és a kecsketermelés kiterjedt. 8 különböző állománnyal dolgoztak, a Map minden gyanúsítottja. Az ürüléket zsákokba helyezték, a vérmintákat vákuumcsövekbe antikoaguláns nélkül. Összegyűjtés után a mintákat jéggel ellátott termoszba helyeztük megőrzésük és későbbi elemzésük céljából az Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco egység mezőgazdasági mikrobiológiai laboratóriumában.

Ziehl-Neelsen (ZN) folt

Az összes székletmintát egy speciális sav-alkohol-gyors festéssel (17) elemeztük, amely alapvetően sav-alkohol-rezisztens bacilusok jelenlétét tárja fel, kompatibilisek a Map.

DNS-extrahálás székletmintákból

Beágyazott PCR a térképészleléshez

Az első amplifikációhoz az IS 900-F (5 'TGATCTGGA CAATGACGGTTACGGA 3') és az IS 900-R (5 'CGCGGCACGGCTCTTGTT 3') primereket használtuk, amelyek 563 bp (18) szorzatot amplifikáltak. A PCR-reakció: 45 µl PCR-keveréket tartalmazott (22 mM Tris-HCl, pH 8,4, 1,65 mM MgCl 2, 220 uM dGTP, 220 dATP, 220 uM dCTP, 220 uM dTTP, 2 U Taq-polimeráz (Promega), 300 pM az első IS900-F, 300 pM az első IS900-R és 2 µl DNS-minta A PCR-ciklusok körülményei a következők voltak: kezdeti denaturáció 94 ° C-on 3 percig, majd 35 ciklus 94 ° C-on 1 percig, 56 ° C 1 percig és 72 ° C 1 percig A második amplifikációhoz (beágyazott PCR) 5 µl amplifikált terméket vettünk, és hozzáadunk egy új PCR reakcióhoz, most az IS 900 -IF belső primerekkel (5 'GCCGCGCTGCTGGAGTTGA 3 ') és IS 900-IR (5' AGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTG 3 '), amelyek 210 bp-os terméket állítanak elő, ennek a PCR-ciklusnak a feltételei megegyeztek. A második amplifikációból nyert termékeket elektroforézissel 1% -os agarózgélen festettük etidium-bromidban (18).

Csak az állományhoz tartozó állatok szérumait használtuk pozitív amplifikációval a Map számára. A "Paratuberculosis Screening Ab kit" kereskedelmi rendszert (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) (19) a gyártó előírásainak megfelelően alkalmazták a technika végrehajtásához.

DNS-extrahálás székletmintákból

A 139 mintán DNS kivonási és vizualizációs eljárást hajtottunk végre. E minták közül csak 54-ben volt egyértelmű DNS-jelenlét. Az (1. ábra) néhány mintából kivont DNS-t megfigyeljük, amint ez az ábrán látható, a kapott DNS enyhe lebomlást mutat, ami nem befolyásolta a PCR technika fejlődését, egyes mintákban is értékelni lehetett az RNS jelenléte, amely normális, figyelembe véve az alkalmazott extrakciós protokollt.

avium

Ziehl-Neelsen (ZN) folt

A minták ZN-festéssel történő elemzése során a vizsgált 139 mintából 6 pozitív volt a festés szempontjából, vagyis a Map-vel kompatibilis sav-alkohol-gyors bacillusok (2. ábra, 1. táblázat). Az A állomány esetében a 4 pozitív minta 20% -ot, míg a D-állománynál a festésre pozitív minták 4% -át figyelték meg, végül a H-állományban pozitív festési mintát kaptak, amely a teljes állomány 8,3% -át teszi ki.

A mintákkal való felhasználása előtt a PCR technikát Map törzs DNS-ével standardizálták. Ezt a DNS-t használták az összes elemzésben pozitív kontrollként. Az összes elemzett minta közül 7 pozitív eredményt hozott beágyazott PCR-ben (3. ábra). Meg kell jegyezni, hogy ez a 7 minta az A állományból származott, egybeesve három pozitív mintával ZN festés és öt ELISA vizsgálattal (1. táblázat). Ez a hét minta az összes minta 5,03% -át teszi ki; és az 1. állomány összes mintájának 35% -a, ahol nagyobb volt a Map-pozitív minták gyakorisága .

A szérumok elemzése ELISA módszerrel

Csak a Map pozitív állományok szérumait elemeztük PCR és ZN festéssel, a kapott eredményeket a 2. táblázat mutatja, ahol negatív és pozitív referenciaértékek szerepelnek. Ezen adatok felhasználásával 0,438-as határértéket állapítottak meg, amint azt Kurstak javasolta (20). Ezt az értéket figyelembe véve az A3, A18, A8, A11 és A16 minta pozitív volt. Az A11 és A18 minták esetében az eredmények egybeesnek a PCR-tesztben kapott eredményekkel.

A paratuberculosis világszerte elterjedt fertőző betegség, amely negatívan befolyásolja az állattenyésztést. Mexikóban a betegség előfordulási helyzete ismeretlen, és a kiskérődzőknél kevés jelentés található. Ebben a munkában a Map jelenlétét egy kecskeállományban jelentik Tecozautlában (Hidalgo), ez az első térképi jelentés ezen a területen. Korábban Chávez et al. (8) a Mexikó-völgyben található kecskeállományban különböző módszerek segítségével kutatást folytatott ennek a mikroorganizmusnak. Ez a munka az előzővel együtt képezi a Map első jelentését kecskékben.

Különböző módszereket dolgoztak ki egy fertőző ágens jelenlétének meghatározására a populációban, logikailag az első az izoláció; azonban számos patogén mikroorganizmus, különösen a Mycobacterium spp. nemzetség esetében, az izolálás nehéz és kockázatot jelent, mivel e nemzetség egyes fajai zoonotikusnak számítanak (10,18). Ebben a munkában közvetlen és közvetett módszereket alkalmaztak, az első esetben a PCR technikán alapuló molekuláris módszer alkalmazásáról döntöttek, amely feltárja a DNS jelenlétét a klinikai mintákban. Ennek a módszernek az az előnye is, hogy biztonságos módszer, mivel nem dolgozik közvetlenül a szerrel. Ezzel a módszertannal hét pozitív mintát azonosítottak, összesen 139-ből. A pozitív minták ugyanahhoz az állományhoz tartozó állatokból származnak, ahol 20 mintát vizsgáltak. Chávez és mtsai. (8) egyetlen 27 állatból álló állománnyal dolgozva 4 esetben izoláltak és kb. 14 hétig tartottak; esetünkben a pozitív állatok azonosítása csak két napot igényelt.

Ez a munka egy új protokollt is bemutat a székletmintákból történő DNS-kivonáshoz, ez az eljárás guanidin-izotiocianátot használ, és lehetővé teszi a nukleinsavak hatékony kivonását. Ezt a módszert korábban nem alkalmazták, mivel számos olyan vizsgálatban, ahol mintát használnak a székletre, kereskedelmi rendszereket alkalmaznak, amelyek növelik az elemzés költségeit (21,22); azonban ebben az esetben a kidolgozott módszer alacsony költségekkel jár.

A Mycobacterium nemzetség mikroorganizmusainak közvetlen megfigyelése a klinikai mintákban (kenetmikroszkópia) egy másik azonosítási módszer, amely kihasználja e baktériumok azon képességét, hogy megtartsák az elsődleges foltot, még savas alkohollal történő színtelenítés után is. rezisztens (AAR) kimutathatja, kizárva a székletben jelen lévő egyéb baktérium nemzetségeket, például a negatív vagy pozitív bacilusokat. Zimmer és mtsai. (23) 1999-ben arról számolt be, hogy a Ziehl-Neelsen festési teszt érzékenysége klinikai tünetekkel rendelkező állatokban 49,3%, szubklinikai állatokban pedig 19,3%. Ezen a ponton tisztázni kell, hogy ugyanez a szövettani metszeteken végzett teszt meggyőzően megalapozta a Mycobacterium spp. a belekben granulomatosus elváltozások kialakulásával.

Másrészt Tripathi és mtsai. (16) kecskebélmintákkal dolgozva sikerült a bélmintákban 80% -os korrelációt megállapítani a MapR és IS900 amplifikációra utaló elváltozásokkal és szövettanral a PCR-tesztben. Ebben a munkában 6 székletmintában mutatták ki az AAR bacillusok jelenlétét, figyelembe véve a korábbi adatokat, elmondható, hogy ezek az állatok pozitívak voltak a Map-re. Más vizsgálatokhoz hasonlóan a kenetmikroszkópiában kapott eredmények korrelálnak a PCR-ben elért eredményekkel.

Whittington és mtsai. (24) arról számoltak be, hogy a Mycobacterium avium paratuberculosis izolálási technikákkal nem mutatható ki két évesnél fiatalabb, baktériumokkal fertőzött állatokban, mivel minimális mértékben kiküszöbölik a Mycobacterium avium paratuberculosis szintjét. Ebben a tekintetben a jelen munkában hét Mycobacterium pozitív mintát nyertek PCR technikával három évesnél fiatalabb állatokból származó mintákban, megállapítva, hogy ez a technika alkalmazható fiatal állatokban a paratuberculosis diagnosztizálására.

Végül az ELISA-ban nyert adatok tekintetében csak a pozitív állományt elemeztük PCR-rel; ebben az állományban a paratuberculosis előfordulása 25% volt. Voltak azonban olyan állatok, amelyek nagyon közel voltak a határértékhez (20), amelyek negatívak voltak ebben a munkában, így az előfordulási érték magasabb lehet. E tekintetben, bár az ELISA szerológiai teszt nagyobb érzékenységgel rendelkezik, fontos tisztázni, hogy különböző tényezők is zavarják ezt, például az állat állapota. Tripathi és mtsai. (16) fertőzött állatokat vizsgált PCR és ELISA segítségével, és megállapította, hogy egyes esetekben nem volt magas titer, sőt negatív is volt, ami egybeesik az ebben a munkában látott eredményekkel.

A Mycobacterium avium paratuberculosis jelenlétét az IS900 inszerciós szekvencia, a ZN festés és az ELISA detektálásán alapuló PCR diagnosztikai teszttel igazoltuk egy kecskeállományban Tecozautlában (Hidalgo). Szükséges, hogy több tanulmány készüljön Mexikó különböző területein a Map jelenlétének kizárása vagy megerősítése érdekében, mivel nincs elég információ a Map kecskékről.

1. Harris NB, Barletta RG. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis az állatgyógyászatban. Clin Microbiol Rev. 2001; 14 (3): 489-512.

2. Villarino MA, Scott HM, Jordan ER. A Mycobacterium avium paratuberculosis alfajú szerológiai antitestek kimutatásakor a paritás hatása a holstein tehenek napi és élettartama alatti tejtermelés csökkenésére. J Anim Sci. 2011; 89: 267-276.

3. Weigand PV, Goethe R. A Mycobacterium avium paratuberculosis fertőzések patogenezise kérődzőknél: még mindig több kérdés, mint válasz. Microb Infect. 1999; 1 (13): 1121-1127.

4. Carslake D, Grant W, Green Laura E, Cave J, Greaves J, Keeling M és mtsai. Szarvasmarha endémiás betegségek: összehasonlító epidemiológia és irányítás. Phil Trans R Soc B. 2011; 366: 1975-1986.

5. Fiorentino MA, Gioffré A, Cirone K, Morsella C, Alonso B, Delgado F és mtsai. A Mycobacterium avium subsp. Első izolálása. paratuberculosis tejelő kecskében Argentínában: Patológia és molekuláris jellemzés. Small Rum Res. 2012; 108 (1-3): 133-136.

6. Maheshwari A, Fakhruddin F, Tanwar RK, Chahar A, Singh AP. A paratuberculosis szerepedenciája kecskéknél Bikanerben. Állatorvos 2012; 13 (1): 28-29.

7. Medeiros L, Junior FG, Almeida AP, Lucena EA, Riet-Correa F. Paratuberculosis kecskékben és juhokban Paraiba államban. Brazil állatorvosi kutatás. 2012; 32 (2): 111-115.

8. Chávez GG, Trigo TF, Svastova P, Pavlik I. A Mexikó középső részéből származó kecskékből származó Mycobacterium avium paratuberculosis izolátumainak genetikai polimorfizmusának azonosítása. Vet Mex. 2004; 35 (1): 72-82.

9. Preziuso S, Magi GE, Renzoni G. Mycobacterium avium subsp. Kimutatása. paratuberculosis a bél- és emlőszövetekben, valamint juhok nyirokcsomóiban különböző technikákkal és kapcsolata az enterális elváltozásokkal. Small Rum Res. 2012; 105: 295-299.

10. De Juan LÀJ, Romero B, Bezos J, Castellanos E, Aranaz A és mtsai. Négy különböző táptalaj összehasonlítása szarvasmarhákból és kecskékből izolált II. És I/III. Típusú Mycobacterium avium paratuberculosis törzsek izolálására és növekedésére. Env Microb. 2006; 72 (9): 5927-5932.

11. Hailat N, Fayyad A, Ababneh M, Hananeh W, Rezig FE, Jaradat S. Mycobacterium avium subsp. PCR-restrikciós endonukleáz elemzése. paratuberculosis izolátumokat kecskékből, juhokból és szarvasmarhákból Jordániában. Comp Clin Pathol. 2012; 21 (5): 755-760.

12. Forde T, Kutz S, de Buck J, Warren A, Ruckstuhl K, Pybus M és mtsai. A Mycobacterium avium paratuberculosis fertőzés alfajának előfordulása, diagnosztizálása és törzstipizálása Alberta délnyugati részén található sziklás hegyi nagyszarvú juhokban (Ovis canadensis canadensis). J Wildlife Dis. 2012; 48 (1): 1-11.

13. Díaz FO, Banda VR, Jaramillo LM, Arriaga CD, González DS, Estrada C. Mycobacterium bovis-t hordozó szarvasmarhák azonosítása immunológiai és molekuláris technikákkal. Vet Mex. 2003; 34 (1): 13-26.

14 Stanley EC, Mole RJ, Smith RJ, Glenn SM, Barer MR és mtsai. Új, kombinált gyors módszer kidolgozása fág és PCR alkalmazásával az életképes Mycobacterium paratuberculosis baktériumok 48 órán belüli kimutatására és azonosítására. Appl Envir Microb. 2007; 73 (6): 1851-1857.

15. Collins DM, May De Zoete, Cavaignac SM. A szarvasmarhákból és juhokból származó Mycobacterium avium paratuberculosis törzsek újszerű DNS-szekvencia-különbség alapján PCR-vizsgálattal különböztethetők meg. J Clin Microb. 2002; 40 (12): 4760-4762.

16. Tripathi BN, Periasamy S, Paliwal OP, Singh N. Az IS900 szöveti PCR, baktériumtenyészet, johnin és szerológiai tesztek összehasonlítása a kecskékben természetesen előforduló paratuberculosis diagnosztizálására. Állatorvos. 2006; 116: 129-137.

17. Carter GR. Diagnosztikai eljárások az állat-egészségügyi bakteriológiában és mikológiában. 1984; 4. kiadás, Charles C Thomas Kiadó, USA.

18. Jumeum, Spergser J, Rosengarten R. Szarvasmarha- és állatkerti állatokból származó Mycobacterium avium p aratuberculosis gyors kimutatása Nested PCR-rel. African Health Sci. 2001; 1 (2): 83-89.

19. Collins MT, Scott JW, Petrini KR, Collins JE, Schultz RD, Whitlock RH. Öt antitest-kimutatási teszt értékelése a szarvasmarha-paratuberculosis diagnosztizálására. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12 (6): 685-692.

20. Kurstak E. Enzim immundiagnosztika. 1986. Kanada, Academic Press.

21 Wells SJ, Collins MT, Faaberg KS, Wees C, Tavornpanich S, Petrini KR és mtsai. Gyors széklet PCR teszt értékelése a Mycobacterium avium p aratuberculosis kimutatására tejelő szarvasmarháknál. Klinika Vac Immunol. 2006; 13 (10): 1125-1130.

22 Stabel JR, JP Bannantine. Egymásba ágyazott, ISMap02 elemet célzó beágyazott PCR-módszer kidolgozása Mycobacterium avium paratuberculosis kimutatására székletmintákban. J Clin Microb. 2005; 43 (9): 4744-4750.

23 Zimmer K, Dräger KG, Klawonn W, Hess RG. Hozzájárulás a szarvasmarhák Johne-kórjának diagnosztizálásához. Összehasonlító vizsgálatok a Ziehl-Neelsen festés érvényességéről, a széklet tenyésztéséről és a kereskedelemben kapható DNS-Probe tesztről a Mycobacterium paratuberculosis kimutatására szarvasmarhák székletében. Zentralbl Vet Med B. 199; 46 (2): 137-40.

24 Whittington RJ, Ian BM, Vanessa S, Grant IR, Juste R, Sevilla IA és mtsai. Genomikailag és földrajzilag változatos Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Különböző vendéglátóktól izolálva. Clin Microbiol. 2011; 49 (5): 1822-1830.

Beérkezett: 2012-20 4-5.
Elfogadva: 2013-17-17.

A magazin teljes tartalma, kivéve, ha azonosítják, a Creative Commons Licenc alatt van