Összegzés
Absztrakt
Bevezetés
Az ideggerinc (NC) sejtjei gerinces neuruláció során jelennek meg az epidermisz és az ideghám között. Szaporodnak és széles körben vándorolnak a fejlődő embrióban, és lenyűgöző sokféle utódsejt-típust hoznak létre, beleértve a csontot/porcot, a koponya-arc vázat, az érzékszervi idegeket, a Schwann-sejteket, a melanocitákat, a simaizomsejteket, az enterális idegsejteket, az autonóm idegsejteket, a kromaffinsejteket, szív septum sejtjei, fogai és mellékvese/pajzsmirigy sejtjei 6. Ezért az NC sejtek vonzó sejttípust jelentenek az őssejtmező számára, és fontosak különféle betegségek, például a Hirschsprung-kór 7, a családi dysautonomia 8, mint pl. valamint rákos megbetegedések, például a neuroblastoma 9. Ezenkívül lehetőséget kínálnak az emberi embrionális fejlődés in vitro tanulmányozására.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
1. Tenyésztő táptalaj, bevont lemezek előkészítése és hPSC-k karbantartása
Előkészítés 1.1 Táptalaj
Megjegyzés: az összes szűrőközeget sterilizálásra, és legfeljebb 2 hétig 4 ° C-on, sötétben tárolják. A vállalat és a katalógus reagensneveinek száma a Anyagtáblázat.
- DMEM/10% FBS: Keverjen össze 885 ml DMEM-et, 100 ml FBS-t, 10 ml penicillint/sztreptomicint és 5 ml L-glutamint.
- HES-táptalaj: Keverjen össze 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamin, 5 ml penicillin/sztreptomicin, 10 ml minimális MEM esszenciális aminosavoldat, 1 ml β-merkaptoetanol. A táptalaj szűrése után adjunk hozzá 10 ng/ml FGF-2-t.
VIGYÁZAT: A β-merkaptoetanol mérgező, kerülje az inhalációt, a lenyelést és a bőrrel való érintkezést. - KSR-differenciáló táptalaj: Kombináljon 820 ml Knockout DMEM-et, 150 ml KSR-t, 10 ml L-glutamint, 10 ml penicillin/sztreptomicint, 10 ml MEM minimális esszenciális aminosavoldatot és 1 ml β-merkaptoetanolt.
- N2-differenciáló közeg: Oldjunk fel 12 g port 980 ml DMEM/F12 dH20-ban, adjunk hozzá 1,55 g glükózt, 2 g nátrium-hidrogén-karbonátot és 100 mg APO humán transzferrint. Keverjünk össze 2 ml dH2O-t 25 mg humán inzulinnal és 40 µl 1 N NaOH-val, és adjuk hozzá az oldott oldatot a táptalajhoz. Adjunk hozzá 100 liter putreszine-dihidrokloridot, 60 l szelenit, 100 l progeszteront, és a térfogatot dH 2 O-val 1 literre emeljük.
1.2 A tenyészlemezek bevonata
1.3 A hPSC-k karbantartása
Megjegyzés: A hPSC-ket 0,1% zselatinban és mitotikusan inaktivált egér embrionális fibroblasztokban (MEFS) tartjuk HES-táptalajban, kiegészítve 10 ng/ml FGF-2-vel, amint azt korábban leírtuk 10,12. A sejteknek 6-8 naponként meg kell osztódniuk.
- Vegyen be egy 10 cm-es edényt szobahőmérsékleten 5 percig 8 ml 0,1% zselatinnal (1x PBS-ben magnézium vagy kalcium nélkül).
- Kiolvasztjuk a gyorsfagyasztott MEF-eket 37 ° C-os vízfürdőben, és adjunk hozzá 1 millió MEF-t 10 ml DMEM/10% FBS-hez.
- Szívja le a zselatint és lemezezze le a sejteket. Inkubáljuk 37 ° C-on legalább 6 órán át.
- Az előkészített MEF lemezről szívja le a DMEM/10% FBS-t, mossa le a lemezt egyszer 1x PBS-sel, és adjon hozzá 10 ml HES-táptalajt, kiegészítve 10 mM Y-27632 dihidrokloriddal. Hagyja a közeget 20 percig 37 ° C-ra melegedni.
Megjegyzés: A hPSC-k kézi felosztásához beépített mikroszkóppal ellátott lamináris áramlású burkolatot használnak. A sejteket azonban megfelelő alternatív módszerekkel passzálhatjuk. - Beépített mikroszkóppal ellátott lamináris áramlású motorháztető alatt különálló telepeket különítsen el egy mobil daru segítségével, és hagyja lebegni.
- 1 ml-es fecskendővel szívja fel az úszó telepeket, és küldje őket a hűvös, meleg MEF lemezre. Vigye a sejtek mintegy negyedét az új edénybe. Inkubáljuk 37 ° C-on.
- Táplálja a sejteket naponta friss HES táptalajjal.
2. A hPSC-k lemezelése differenciálásra
Megjegyzés: A hPSC-knek meg kell osztaniuk vagy be kell vonniuk a differenciálást, ha a telepek nagyok, de mégis élesek, a lehető legkevesebb cellával rendelkeznek, amelyek a határukon differenciálódnak (lásd: 1B. Ábra). Amikor a sejteket kézi áthaladással tartják fenn, a telepeknek elég nagyoknak kell lenniük ahhoz, hogy a szem könnyen láthassa őket. Ahhoz, hogy megfelelő érzést kapjon erre az időpontra, két hétig külön HPSC lemezt tarthat áthaladás nélkül, és figyelheti, hogy a sejtek eljutnak-e és elhaladnak-e az átjutás/differenciálás ideális időpontjában.
3. A neuronok differenciálódásának kiváltása
Megjegyzés: A differenciálás megkezdhető (0. nap), amikor a sejtek 90-100% -ban összefolynak (lásd 1C. Ábra), általában másnap. Ha a pontos összefolyás nem érhető el, a sejteket mindennap HES-táptalajjal táplálhatjuk, amíg készen állnak a differenciálódásra. Alternatív megoldásként a beoltott sejtek kezdeti száma növelhető.
- A 0–3. Napon táplálja a sejteket naponta 10 ml/10 cm KSR-differenciáló táptalajjal, amely 0,1 µM LDN193189 és 10 M SB431542.
- A 4. és az 5. napon a sejteket 75% KSR-differenciáló táptalajjal és 25% N2-differenciáló tápközeggel etessük, mindkettő tartalmaz LDN193189 és SB431542.
- A 6. és a 7. napon a sejteket 50% KSR-differenciáló táptalajjal és 50% N2-differenciáló tápközeggel etessük, mindkettő tartalmaz LDN193189 és SB431542.
- A 8. és 9. napon a sejteket etessük 25% KSR-differenciáló táptalajjal és 75% N2-differenciáló táptalajjal, mindkettő tartalmaz LDN193189 és SB431542.
- A 9. és 10. napon PO/Lam/FN ételeket készítünk az 1.2.2. Pontban leírtak szerint a sejtek 11. napon történő replikálására.
- A 10. napon sejteket táplálunk N2-differenciáló táptalajjal, amely LDN193189 és SB431542-et tartalmaz.
4. Cseppek cseréje az NC specifikációk szerint
5. Az NC sejtek aktivált sejtválogatásának (FACS) fluoreszcenciája
Megjegyzés: A sejtek FACS előkészítése körülbelül 2 órát igényel.
6. Besorolt cellák cseréje, NC karbantartás és bővítés
Megjegyzés: A válogatott FACS sejteket különös gonddal kell végrehajtani az optimális túlélés biztosítása érdekében. Addig tartsa őket jégen, amíg újból be nem vetette őket. Ne rázza vagy pipetta erősen. A sejtek a cső működtetésével újraszuszpendálhatók.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
2. ábra Az MS5-R-NC vagy az R-NC protokollal nyert sejtek összehasonlítható idegi címersejt-azonossága. Mindkét protokollban a sejtek áthaladnak egy neuronális rozetta állapoton. A rendezett NC sejtek morfológia és az NC markerek, például a HNK-1 és az AP-2 expressziója alapján azonosak. Az NC-sejtek nestin-pozitívak, ami azt mutatja, hogy progenitor sejtek. Mérleg: 200 m. Az összes fluoreszcencia képet ellenfestettük a DAPI számára. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Az összes HPSC terepi alkalmazáshoz elengedhetetlen a pontos, reprodukálható, meghatározott és specifikus in vitro differenciálási protokollok rendelkezésre állása. Ebben a jelentésben bemutatjuk a differenciálódásban létrehozott in vitro protokoll adaptációját az R-NC sejtek hPSC-kből történő származtatásához. A jelentett protokoll ugyanazokat a sejteket állítja elő, mint korábban 10, meghatározottabb tenyésztési körülmények között és rövidebb idő alatt. Ez a protokoll felhasználható R-NC-sejtek előállítására az észak-karolinai törzs sejtjeit érintő emberi betegségek esetén, vegyületkutatásra, toxikológiai vizsgálatokra és az NC-származékból származó sejttípusokat célzó differenciálási protokollok kidolgozására.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Közzétételek
A szerzőknek nem áll fenn összeférhetetlenségük.