George Beadle és Edward Tatum a Neurospora gombával végzett úttörő tanulmányaik során 1: 1: 1 összefüggést javasoltak a gén, az enzim és a biokémiai reakció között. De az a kérdés, hogy az egyes gének nukleotidszekvenciája hogyan viszonyult a kódolt fehérje aminosavszekvenciájához, továbbra is megválaszolatlan kérdés maradt.

jött

A Nature 1961-es "A fehérjék genetikai kódjának általános természete" című cikkében Francis Crick, Leslie Barnett, Sydney Brenner és Richard Watts-Tobin végül megoldotta a rejtvényt. Helyesen állapították meg, hogy a genetikai kód hármas kód, a kód redundáns (degeneráltnak is nevezik: a redundancia vagy a degeneráció a genetikai kód egyik jellemzője, a nukleinsavak nukleotidszekvenciája és az aminosavak szekvenciája közötti megfelelés szabálya). a polipeptidek; arra utal, hogy a genetikai információk tárolásához szükségesnél több különböző kodon van), a hármasok nem fedik egymást, nincsenek vesszők (bár az intronokat utólag fedezték fel), és az egyes nukleotidszekvenciákat kiindulópontból olvassák egy meghatározott kiindulási ponttól.

1961-ben az egyetlen analitikai eljárás, amely felhasználható a gén feltételezett nukleotidszekvenciájának megrendelésére, a genetikai struktúrák feltérképezése mutánsok alkalmazásával, amelyekben a gén megváltozott. Az ezen eljárással feltérképezett mutációval megváltozott helyek feltételezett nukleotidváltási helyek voltak.

Crick és munkatársainak szerencséjére Seymour Benzer az 1950-es évek végén elegáns vizsgálatot dolgozott ki a mutációk felhasználásával a T4 fág rII régiójában (amelynek két szomszédos génje van, az úgynevezett cistron A és B - a cistron a genetikai anyag legkisebb egysége) képes felelősséget vállalni egy polipeptid szintéziséért). Ezzel a rendszerrel Benzer megadta az első részletes szerkezeti térképet egy genetikai régióról, jelen esetben a fággenomról.

Annak ellenére, hogy képtelen volt szekvenálni a DNS-t, Crick és munkatársai meg voltak győződve arról, hogy mutagenezist és genetikai rekombinációt használhat a T4 rII rendszerrel a genetikai régió megváltozott helyeinek feltérképezéséhez és a genetikai kód általános jellegének megállapításához.

Benzer térképe a T4 rII régióról összhangban volt azzal a következtetéssel, hogy minden gén nukleotidok lineáris szekvenciájából állt, amelyek mindegyike örökölhető változáson ment keresztül, amely megváltoztathatta a fehérjeterméket. Azt, hogy a polipeptidek lineáris aminosavszekvenciákból is álltak, Fred Sanger és mások már korábban megállapították.

Aztán 1958-ban Vernon Ingram kimutatta, hogy egy mutáns humán hemoglobin-polipeptidnek csak egy aminosav-változása volt. Az ezekből és a kapcsolódó vizsgálatokból származó logikai következtetés az volt, hogy mindegyik gén egyedülálló lineáris nukleotidszekvenciából állt, és hogy ezt a szekvenciát egyedülálló lineáris aminosav-szekvenciává alakították át. Ha ez az értelmezés helyes volt, akkor kellett lennie egy „genetikai kódnak”, amely az egyes gének nukleotidszekvenciáját és a kódolt fehérje aminosav-szekvenciáját kapcsolja össze.

Crick javasolta az "adapter" hipotézist - miszerint specifikus molekulák (amelyeket később tRNS-ként azonosítottak) felelősek egy adott nukleotidszekvencia specifikus aminosavvá történő "fordításáért". Brenner viszont összehasonlította a fehérjék ismert aminosav-szekvenciáit, és arra a következtetésre jutott, hogy a genetikai kód nem fedheti át az átfedéseket (a sok lehetőség egyike), mert mindegyik aminosav a másik 19 aminosav szomszédságában helyezhető el.

Crick stratégiája a potenciális "kódok" helyes meghatározására azon a meggyőződésen alapult, hogy a mutagének, az akridin színezékek (például a proflavin) egy csoportja bázispár addíciókat vagy csökkenést okozott a DNS-ben. Akkoriban nem ez volt az uralkodó nézet, de adataik alátámasztották. Ezzel az értelmezéssel összhangban volt az a megfigyelés, hogy az akridin által kiváltott DNS-mutációk szokatlan jellemzőkkel bírnak: teljesek vagy nem szivárognak (vagyis a mutáció a génfunkció teljes elvesztéséhez vezetett). Ez azt sugallta, hogy ezek a mutációk megakadályozták a kódoló régió megfelelő transzlációját a mutációs hely 3'-vége (lefelé) felé.

Crick és munkatársai továbbá azzal érveltek, hogy egy bázispár hozzáadásával okozott mutációt el lehet nyomni egy ellentétes típusú szoros mutációváltással, egy bázispár eltávolításával. Ez a második változás helyreállítaná a "természetes" olvasási keretet, a második mutáció helyének 3'-vége felé. Így csak a 2 mutációs változás helyszíne közötti DNS-szekvencia által meghatározott polipeptidszegmens változik meg.

Ezeket az előrejelzéseket egy proflavin által indukált T4 rII mutáns alkalmazásával tesztelték, amelyet FC0-nak jelöltek. Önkényesen feltételezték, hogy ez a mutáns egy bázispár ("+") hozzáadása eredményeként keletkezett. Ez a mutáció a T4 rII régió Cistron B specifikus szegmensének egy olyan helyéhez társult, amely Benzer szerint nem volt elengedhetetlen az rII B működéséhez. Ennek a genetikai régiónak az elemzéshez való kiválasztásának jelentősége az volt, hogy elvárható, hogy az aminosavak megváltozott szekvenciája a + (bázispár-hozzáadás) és - (bázispár-eltávolítás) változások közötti DNS-szegmens által a kiválasztott B régióban nem lenne káros.

Valóban, amikor kezdeti elemzéseiket FC0 szelekcióval végezték az rII + funkciót helyreállító mutációkra vonatkozóan, sok szuppresszív változást figyeltek meg a második helyen; ezek az FC0 mutációs hely két oldalán lévő szomszédos helyekhez vannak feltérképezve. Ezután genetikai rekombinációval elválasztották ezeket a szuppresszor változásokat az FC0 mutációtól, és megfigyelték, hogy minden szuppresszor változásnak, ha csak az rII B-ben van mutáns fenotípusa is. Ezek a különálló elnyomó változások általában teljesek voltak, összhangban azzal a várakozással, hogy mindegyik egy bázispár eltávolításának volt köszönhető.

A kutatók izolálták a szuppresszorokat ezekből a szuppresszorokból; ezeknek bázispár addícióknak kellett lenniük, mivel megfordították a korábban izolált szuppresszorok mutáns fenotípusát, és feltételezték, hogy "szemetelők". A mutációk egyesítésével a különböző halmazokban azt figyelték meg, hogy csak 2 osztály létezik: azok, amelyekhez úgy tűnik, hogy hozzáadtak egy bázispárt, és azok, amelyekről úgy tűnt, hogy egy bázispár törlése.

Így egy mutációváltozás egy osztályban, ha az ugyanazon osztályban levő mutációs változással kombinálódik, mutáns fenotípust eredményez, míg a második osztályban szomszédos mutációs változással kombinálva az rII + fenotípus figyelhető meg. Pontosan ezt találták: a legtöbb szuppresszor mutáció viszonylag közel volt az elsődleges „szuppresszor” mutáció helyéhez.

Úgy tűnt, hogy az alappár hozzáadását eredményező olvasási hibát csak egy szomszédos alappár eltávolításával lehet kijavítani. Ez arra utal, hogy létezik egy nukleotid-triplett kód, és hogy néhány kódoló triplettet nem lehet lefordítani, esetleg fordítási "csúcsként" szolgálnak. A szerzők azt is megfigyelték, hogy néhány +/- kombinációjuk ál-vad típusú fenotípussal rendelkezik, összhangban azzal a várakozással, hogy a 2 mutációs változás helyszínei között a DNS-szegmens által meghatározott aminosav-szekvenciák tartalmazhatnak olyan aminosavat, amely csak részben működőképes volt abban a helyzetben.

Ezután további elemzést végeztek, amelynek fő céljára összpontosítottak, meghatározták a genetikai kód általános jellegét. Úgy vélték, hogy ha a genetikai kód egy hármas kód, akkor 3 mutációs változás + vagy 3 mutációs változás kombinációja egy vad vagy ál-vad típusú fenotípusú fágot eredményez. Pontosan azt találták. Ezekben a hármas mutánsokban feltehetően egy aminosavat adtak a B fehérjéhez vagy eltávolították a fehérjéből. Ezek a megállapítások meggyőző bizonyítékokkal szolgáltak arra a következtetésre, hogy a genetikai kód hármas kód volt.

Crick, Barnett, Brenner és Watts-Tobin egy újabb tesztet készítettek értelmezéseik logikájáról, kihasználva a látszólag génfúziót. Bevezették a + és - mutációs változásokat az 1589 nevű speciális deléciós mutáns A cisztronjában, amelyben feltételezték, hogy a cisztron rII A tisztítatlan szegmense fuzionált a B cisztron maradék részével. Ez a deléciós mutáns azonban megtartotta a B fehérje funkcióját ami azt sugallja, hogy a B cisztron maradék DNS-szakaszát lefordították egy megfelelő leolvasási formába, és olyan AB-polipeptidet állítottak elő, amely megtartotta a B-funkciót.

Normális esetben az A vagy B cisztron mutációi nincsenek hatással a másik cisztron expressziójára, összhangban azzal a ténnyel, hogy az rII A és az rII B külön gének. Mutációs + vagy - változások bevezetése a fennmaradó rII-ben Az 1589 deléciós mutáns egy része az előrejelzések szerint megszüntette az rII B aktivitást, azonban amikor a + és - változásokat kombinálták az 1589 rII A régióval, a B aktivitás helyreállt. Ezek az eredmények összhangban voltak azzal a következtetéssel, hogy egy gén nukleotidszekvenciája lineárisan transzlálódik, kezdve egy fix kiindulási ponttól, és addig folytatódik, amíg a transzláció stop-jele észlelhető.

Később további kísérleteket végeztek annak tesztelésére, hogy a DNS-fehérje kódoló kapcsolat lehet-e 6 nukleotid/aminosav helyett 3 nukleotid/aminosav helyett, amelyet adataik szerint előnyben részesítettek.

Minden megállapításuk összhangban volt azzal a következtetéssel, hogy minden egyes akridin által kiváltott mutáció egyetlen bázispár hozzáadását vagy eltávolítását vonta maga után, nem pedig 2 bázispár hozzáadását vagy eltávolítását. Felismerték azonban, hogy ezek a vizsgálatok nem zárják ki teljesen a 6 nukleotid lehetőségét. Azt is állították, hogy eredményeik jobban megfelelnek a redundáns kódnak. Mivel 64 (4x4x4) különböző hármas szekvencia volt és csak 20 aminosav volt, ebből a hármasból 44 feltehetően magas szekvenciákat kódolna, vagy más funkciót is elláthatna, ha a kód nem lenne felesleges. Ha 44 hármas lenne stopkodon, akkor a szerzők úgy vélték, hogy nagyobb nehézségeket tapasztaltak volna az rII működésének helyreállításában a + és - mutációs változások kombinálásával. Mivel az addíciós és deléciós mutációs változások nagy részét deléciós mutációk mentették meg, a kettő között nem lehetett volna megállító kodont bevezetni. A legvalószínűbb magyarázat az volt, hogy a genetikai kód rendkívül felesleges.

A cikkében leírt kísérleti elemzések rendkívül meggyőzőek. Az utolsó bekezdések egyikében megemlítik Marshall Nirenberg 1961-ben a moszkvai biokémiai kongresszuson tett bejelentését, miszerint Matthaei-val egy poliuridil-sav RNS-t adtak sejttel in vitro fehérjeszintézis rendszerhez, amely fenilalanint termelt. Ez magában foglalta a fenilalanin bizonyos uridin-kódszekvenciájának létezését, és ami még fontosabb, hogy a szintetikus RNS-ek fehérjévé transzlálhatók ezzel a sejttelen rendszerrel.

Crick és a többiek Nirenberg és Matthaei egy másik cikkére is hivatkoztak, amelyben egy további megjegyzésükben megemlítik, hogy "a policitidilsav specifikusan közvetíti az L-prolin beépülését egy TCA (triklór-ecetsav) kicsapódó termékbe".

Crick és munkatársai 1961-es tanulmánya megdöbbentő, mivel helyesen következtették a genetikai kód általános jellegét annak ellenére, hogy közvetlen kísérleti elemzéssel nem voltak képesek megfejteni a genetikai kódot. Elemzései zseniálisak, következtetései pedig felbecsülhetetlen adalékok voltak a DNS információtartalmával kapcsolatos ismereteinkhez. Kétségtelen, hogy következtetései bizonyára nagy hatással voltak a szakterület tudósaira a maga korában.

Ez tökéletes példa a gondolkodás és a logika felhasználására az alapvető biológiai problémák megoldására, a tudás és a bölcsesség ötvözésével a fontos tudományos kérdések megválaszolására.