Összegzés

A jelenlegi cikk a magas zsírtartalmú étrendet tápláló egerek előállítását és metabolikus jellemzését írja le az étrend okozta inzulinrezisztencia és elhízás modelljeként. Részletes protokollokkal rendelkezik az orális glükóz tolerancia teszt és az inzulin tolerancia teszt elvégzésére, az egész test monitorozására, a glükóz metabolizmusának változásaira in vivo.

glükóz

Absztrakt

Bevezetés

A fejlett országokban az elhízás és a cukorbetegség a fizikai inaktivitás és a feldolgozott élelmiszerek túlzott fogyasztása miatt elérte a járványos dimenziókat, a gyors urbanizáció, az iparosítás és a globalizáció hajtotta hatások miatt. Bár az inzulinrezisztencia és társbetegségei, például a hiperlipidémia és az érelmeszesedés kutatása egyre fontosabbá vált az elmúlt évtizedekben, az egészség és anyagcsere anyagcserét szabályozó komplex biológiai mechanizmusok hiányosak maradnak, és továbbra is sürgős szükség van az új kezelési módok megelőzésére és kezelésére. ezek a betegségek 1 .

Az inzulin és ellenszabályozó hormonjai, a glukagon szolgálnak a sejtek energiaellátásának és a makrotápanyagok egyensúlyának fő szabályozói, így fenntartják a megfelelő szisztémás vércukorszint-koncentrációt is. Maga a glükóz a hasnyálmirigy β sejtjeinél az inzulinszekréció egyik fő stimulátoraként működik, míg más makrotápanyagok, humorális tényezők, például az idegi bemenet tovább módosítják ezt a választ. Az inzulin ennek következtében elindítja a táplált állapot anabolikus folyamatait azáltal, hogy megkönnyíti a felesleges vércukorszint diffúzióját izom- és zsírsejtekbe, és további aktiválja a glikolízist, valamint a fehérje- vagy zsírsavszintézist. Ezenkívül az inzulin a glükoneogenezis gátlásával elnyomja a máj glükóztermelését. A krónikus felesleges energiafogyasztás és a meta-gyulladás hiperinsulinémiához és perifériás inzulinrezisztenciához vezet az inzulinreceptor expressziójának alacsony szintű szabályozása, valamint a downstream jelátviteli utak megváltozása miatt, ami az inzulin által közvetített glükóz-ártalmatlanítás érzékenységét, valamint az elégtelen gátlást eredményezi. a máj glükóztermelésének 3, 4, 5, 6 .

A betegség genetikai, táplálkozási vagy kísérleti indukciójával rendelkező állatmodellek széles skálája kiváló eszköznek bizonyult az inzulinrezisztencia és a cukorbetegség különböző formáinak, valamint az azt kísérő betegségek molekuláris mechanizmusainak tanulmányozásához 7. Példa erre a széles körben alkalmazott és jól bevált HFD által indukált egérmodell, amelyet az alacsonyabb metabolikus hatékonysággal kombinált megnövekedett étrendi bevitel miatt gyors súlygyarapodás jellemez, ami inzulinrezisztenciát eredményez 8, 9. Állati és humán modellekben az éhomi vércukor- és inzulinszint emelkedését, valamint a glükóz beadásának tolerancia romlását használják az inzulinrezisztencia és a glükóz metabolizmusának egyéb szisztémás zavarainak indikátoraként. A glükóz és az inzulin vérszintjének monitorozása a kiinduláskor vagy az ingerlés után könnyen hozzáférhető olvasmányok.

Általánosságban egyszerű protokollt biztosítunk a HFD által kiváltott egérmodell előállításához, miközben további két nagyszerű megközelítést írunk le az egész test anyagcserezavarainak tanulmányozására, az usa-t és az ITT-t, amelyek hasznos eszközök lehetnek a betegség patogenezisének vizsgálatához. valamint új terápiák kifejlesztése, különösen az anyagcserével kapcsolatos betegségek, például az inzulinrezisztencia és a cukorbetegség területén.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az itt leírt összes módszert a Bécsi Orvostudományi Egyetem Állattartása és -használata hagyta jóvá, és az Európai Laboratóriumi Állattudományi Egyesületek Szövetsége (Staff) végezte. Felhívjuk figyelmét, hogy a jelen jegyzőkönyvben leírt összes eljárást csak intézményi és kormányzati jóváhagyás után, valamint technikailag hozzáértő személyzet végezheti el.

1. HFD-vel táplált egerek

Megjegyzés: Tartsa az összes C57BL/6J egeret 12 órás világos/sötét ciklusban, szabad hozzáféréssel az ételhez és a vízhez.

  1. 6 hetes korban az egerek 8-12 hétig HFD-n (40-60% kalória zsírból) helyezik el az elhízást, míg a sovány kontrollcsoportnak alacsony zsírtartalmú étrendet (LFD) táplálnak (10% zsírtartalmú kalória).
  2. Heti rendszerességgel határozza meg az egerek testtömegét. A súlygörbéknek hasonló mintákat kell mutatnia mindkét csoportban, nagyobb meredekséggel a HFD-vel táplált csoportban.

Megjegyzés: Ha az OGTT során 15 percenként vérmintavételi időpontokat választanak, akkor a kísérletet legfeljebb 15 egérrel kell elvégezni párhuzamosan, hogy egérenként legalább 1 perc kezelési idő legyen.

Megjegyzés: Az OGTT-vel (egerek, vér, glükométer és vazelin használata) ugyanazokat az óvintézkedéseket kell alkalmazni, amikor az ITT-t végzik. Például minden injekciót 15 percen belül, 1 perces időközönként kell végrehajtani, ha 15 egeret párhuzamosan tesztelnek. Az ITT esetében a későbbi vérvétel kapilláris csövekkel választható.

10 perc 13 egerekben, az inzulin beadása utáni végső különbségek (pl. 2 óra elteltével) nem tükrözhetik az inzulin hatásának közvetlen hatását. Adjon 20% -os glükózoldatot hipoglikémiás egér esetén (a vér 35 mg/dl glükózszintje alatt van), és fennáll a veszélye, hogy meghal.

  • Az utolsó időpontok után helyezze az egereket otthoni ketreceikbe, sok étel és víz elkészítésével.

    • Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Reprezentatív eredmények

    1. ábra étrenden az egerek metabolikus fenotipizálásának ütemtervét mutatja. Körülbelül 6 hetes korban az egereket HFD-be kell helyezni, míg egy LFD csoport szolgálhat kontrollcsoportként. Fontos, hogy a testsúlyt hetente kell meghatározni, hogy kiderüljön, várható-e a testtömeg növekedése. Bármilyen típusú stressz (pl. A férfi zaj vagy agresszív viselkedés) akadályozhatja a testtömeg-növekedést, ezért azonnal meg kell szüntetni. A diétás kísérletekhez minden egércsoportnak legalább 10 egérből kell állnia, mivel ezek a diétás kísérletek lassúak, és a virágzás gyakoriak (pl. Egerek nem híznak vagy egerek kóros glükóz- vagy inzulinszinttel rendelkeznek). A kiválasztott időtartamot követően (a tanulmány hipotézisétől és a várható változások időzítésétől függően) az OGTT és az ITT elvégezhető az inzulinhatás és a glükóz tolerancia értékelésére. Ebben a munkában az anyagcsere-teszt utolsó pillanatait választották.

    Fontos, hogy az OGTT és az ITT között legalább egy hét gyógyulási időnek kell lennie, mivel ezek a kísérletek jelentős vérveszteséghez vezetnek, ezért nagyon megterhelőek az egerek számára. Ha a vérgyűjtés mennyisége csökken (például ha először egy ITT-t végeznek további vérvétel nélkül), akkor ez a gyógyulási időszak is lerövidülhet vagy kihagyható, összhangban a 14., 15., 16., 17. állatok többszörös vérvételére vonatkozó iránymutatásokkal .

    Ebben a nagy, összesen 60 C57BL/6J egérrel végzett vizsgálatban az egerek felét HFD-ben vagy LFD-ben rögzítették 6 hetes korban (n = 30 csoport), és a testtömeg-gyarapodást 16 hétig követtük nyomon diétán. A HFD fogyasztása a testtömeg jelentős növekedését eredményezte, amint az a 4. ábrán látható. 6 hetes korban a testtömeg mindkét csoportban 20,2 g volt. Míg az LFD-s egerek állandó, kissé növekvő testtömeget (31,2 g ± 2,7) mutattak a megfigyelt időszak alatt, a HFD-s egerek gyorsan növelték testtömegüket, különösen az első hetekben, és ezt követően elérték maximális testsúlyukat. a diéta. Bár a súlygörbék hasonló mintázatot mutattak a kísérlet során, a HFD csoportba tartozó egerek 1,5-2-szer nagyobb testtömeget (44,4 ± 4,0 g) értek el, mint az LFD-vel táplált egerek.

    A két kohorsz metabolikus fenotípusának vizsgálatához OGTT-t hajtottak végre (5. ábra)) és az ITT (6. ábra). Mivel a kisméretű rágcsálókban a vér mennyisége korlátozott, a metabolikus fenotipizálási kísérletek során a cukorbetegeknél alkalmazott point-of-care (POC) vizsgálatot (glükométer) alkalmazták a vércukorszint ellenőrzésére. A 2. ábrán látható módon, A vércukorszint-ellenőrzők egyszerűen használhatók, csak egy kis vércseppre van szüksége, és a dokumentáláshoz másodperceken belül megjeleníti a vércukorszintet. 5. ábra az abszolút inzulin és az abszolút glükóz időbeli lefutását mutatja be (5a. ábra)-b) (5. ábra c) szintjei az OGTT alatt. Általában egy normál glükóztoleranciával rendelkező egészséges egér a vércukorszint jellegzetes gyors emelkedését mutatja, a csúcsot a glükóz után 15-30 perccel éri el.

    Az ezt követő, elsősorban izom-, zsírszövet- és májszövet-glükózfelvétel a vércukor-koncentráció fokozatos csökkenéséhez vezet. Minden kísérletben az LFD-vel táplált egerek glükóz-toleráns kontrollcsoportként szolgáltak, és ezért megfeleltek a várható anyagcsere-profilnak: a vércukorszint csúcsa

    A 240 mg/dl-t körülbelül 15 perccel a glükóz beadása után érték el, amelyet azonnal a glükóz után 60 perccel elérő, az alapszintet elérő csökkenés követett, ami megfelelő glükóz clearance-t jelez. Ezzel szemben a HFD-egerek hozzávetőlegesen elérték

    320 mg/dl glükóz, és szinte semmilyen glükóz sem semmisült meg, ami glükózrezisztenciára utal. Amikor a vércukorszint a két csoport között éhgyomri állapotban már eltér (mint ebben a példában), az eredmények igazolásához ki kell számolni a görbe alatti területet (AUC) a bazális glükóz felett (5a. Ábra).- b).

    Ezenkívül a keringő vér inzulinszintjét inzulin ELISA teszt alkalmazásával határoztuk meg (5c. Ábra)) annak érdekében, hogy több információt nyújtson a modellben rejlő patofiziológiáról. Míg az inzulinszint szinte nem változott a kontrollcsoportban, a HFD-vel táplált egerek 16-szorosan magasabbnak bizonyultak a kontroll csoporthoz képest, valamint nagymértékben megnövekedett inzulinválaszt mutattak, ami a HFD által kiváltott hiperinzulinémiát jelzi. csökkent glükóz eliminációs képesség, amelyet az inzulinrezisztencia okozhat. Ne feledje azonban, hogy az OGTT eredményeit nem szabad túlértelmezni, ez a teszt nem közvetlenül értékeli az inzulin hatását, és nem használható fel az inzulinrezisztenciával kapcsolatos állítások lezárására.

    A HFD-vel táplált egerek inzulinérzékenységének mérésére egy ITT-t 1 héttel OGTT után végeztek (6a. Ábra)). Ebben a tesztben az inzulin beadása után a vércukor-koncentráció csökkenésének mértéke jelenti az inzulin működésének hatékonyságát az egész testben. A HFD-vel táplált egerek a vércukorszint csökkenését mutatták az LFD-vel táplált kontroll csoporthoz képest, az ITT minden pontján, ezért inzulinrezisztenciára utalnak. Az ITT-eredményeket általában a glükózszint időbeli lefutásaként mutatják be, de fordítva is megadható, hogy az alapszintű glükóz alatti AUC látható a 6b. Ábra szerint. Ha az összehasonlított csoportok hasonló éhomi vércukorszinttel rendelkeznek (ez a kísérlet nem így van), akkor az ITT alatti glükózszint a bazális glükóz százalékában adható meg. Az egerekhez hasonlóan az inzulinnal szembeni szabályozó válasz aktiválódik, ha a vércukorszint alá csökken

    80 mg/dl 18: ennek az ellenszabályozó válasznak a hibái egy adott egérmodellben tévesen értelmezhetők az inzulinérzékenység növekedéseként. A HFD-k és az azt követő metabolikus fenotípusos kísérletek során gyakran előfordulhat kibontakozás. Azokat az egereket, amelyek nem híznak a HFD-n, vagy azokat, akiknek éhomi éhomi glükóz- vagy inzulinszintje rendellenes, ki kell zárni az elemzésből. Ez utóbbi kettőnél az izolátumok vizsgálata minden kísérleti csoportra külön elvégezhető (pl. Grubbs-teszt)

    Ebben a tanulmányban példaként bemutattuk az in vivo metabolikus kísérletekből származó adatok értelmezését, amelyeket étrend okozta elhízással, glükóz intoleranciával és inzulinrezisztenciával rendelkező egerekben végeztünk, és összehasonlítottunk egy normál testtömegű kontrollcsoporttal. A várakozásoknak megfelelően a következetesen elhízott inzulinrezisztens egerekben csökkent a glükóz tolerancia és a hiperinsulinémia az életkornak megfelelő kontroll egerekhez képest; Ezt jól bevált és megbízható, időben és költségvetés-barát módszerekkel fedezték fel, amelyeket viszonylag könnyű végrehajtani. A glükóz-tolerancia, az inzulinszint és az inzulinérzékenység különbségei, amelyek mind a jelenlegi OGTT és ITT módszerekkel érhetők el, gyakran segíthetnek egy tanulmány következő lépéseinek megtervezésében, amelyek kifinomultabb kísérleteket is magukban foglalhatnak, például hiperglikémiás vagy hiperinsulinémiás bilincseket valamint izolált hasnyálmirigy-szigetekkel végzett kísérletek.


    1. ábra: A javasolt étrend és az in vivo metabolikus kísérletek ütemterve. A HFD metabolikus hatásainak vizsgálatához egerekben a kísérleti csoportba tartozó állatokat körülbelül 6 hetes korban helyezik HFD-be, míg a kontroll csoport LFD-t kap. Az egerek testtömegét hetente kell meghatározni a megfelelő súlygyarapodás felmérése érdekében. Körülbelül 12 hetes diéta után (vagy a kutatási hipotézistől függően kiválasztott időpontban) az egerek metabolikus fenotípusát OGTT-vel értékeljük, majd 1 hét gyógyulási idő, majd ITT. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


    2. ábra A vérmintavétel módszerei metabolikus kísérletek során. Felhasználáshoz, valamint az ITT-hez, ahol ismételt vérmintavétel szükséges, ajánlott vért venni úgy, hogy a farok hegyéből 1-2 mm-es darabot gondosan kivágunk éles ollóval (A változat), majd meghatározzuk a vércukorszint glükométerrel és fokozott vérgyűjtés kapillárisral az inzulinszint és egyéb releváns vérértékek meghatározásához. Alternatív megoldásként a vérből farokvénán keresztül (B variáns) vagy artériás katéterezéssel (nem látható) is lehet mintát venni. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


    3. ábra: Orális glükózszonda (a) és intraperitoneális inzulininjekció (b). Az orális glükóz adagolásának reprezentatív képei etetőtűvel OGTT alatt (a) és intraperitoneális inzulininjekció az ITT során (b). A részletes leírást lásd a protokollban. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


    4. ábra HFD-vel és LFD-vel táplált C57BL/6J egerek súlygyarapodása. A C57BL/6J egerek vagy 60% HFD-t, vagy 10% LFD-t kezeltek kontrollként 20 héten keresztül. Míg a HFD-vel táplált egerek a testtömeg várható növekedését mutatták, különösen a diéta első heteiben, az LFD-vel táplált egerek csaknem állandó testtömeget mutattak a megfigyelt időszak alatt. Az eredmények az átlag ± SEM. * p Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Vita

    Az OGTT és az ITT itt leírt megközelítései gyakran megmagyarázhatják a glükóz tolerancia megfigyelt különbségeit, és arra is utalhatnak, hogy később, kifinomultabb kísérleteket végeznek az alábbiak szerint (például hiperglikémiás bilincsek vagy izolált szigeteken végzett vizsgálatok). Összefoglalva, bemutatunk egy egyszerű protokollt a HFD által kiváltott egérmodell előállításához, és további leírást adunk az OGTT-ről és az ITT-ről, amelyek hatékony eszközök a metabolikus fenotípus in vivo változásainak értékelésére, és hasznosak lehetnek a anyagcserével összefüggő betegség, valamint új terápiás megközelítések.

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.