marker

  • Összegzés
  • Fő
  • Anyagok és metódusok
  • Szövetminták
  • Szövetmátrixok
  • Western Blot elemzés
  • Immunhisztokémiai festés
  • Eredmények
  • Vita

Összegzés

Fő

Egy ismeretlen elsődleges hely rákja a hetedik-nyolcadik leggyakoribb rák, amelyet a klinikai gyakorlatban találtak. 1 A 100 000 lakosra jutó, életkorral korrigált éves előfordulási arány az Egyesült Államokban 7–12, Ausztráliában 18, Hollandiában pedig 6 eset. Ez a negyedik leggyakoribb oka a rákos halálnak mind a férfiak, mind a nők körében. 2 Mivel az optimális rákkezelés az elsődleges tumor helyéhez kapcsolódik, az elsődleges hely azonosításának hiánya jelentős problémákat okoz a betegek kezelése során. Az adenokarcinómák az összes ismeretlen elsődleges helyrák közel felét teszik ki. Az immunhisztokémia alkalmazása specifikus antigének kimutatására a tumorsejteken jelentős javulást eredményezett a rák diagnózisában. Például prosztata-specifikus antigént használnak markerként a prosztatarákra. 3 A pajzsmirigy transzkripciós faktor a tüdőrák markere. 4 A gasztrointesztinális (GI) daganatok esetében azonban még mindig nincs jó marker.

A kadherin-17, más néven máj-bél kadherin vagy humán peptid transzporter-1, a kadherin szupercsalád tagja és Ca2 + -függő sejt-sejt adhéziós molekula. 5., 6. Az úgynevezett klasszikus kadherinektől, például az E, N és P kadherinektől eltérően, a kadherin-17-nek hét kadherinismétlése van az öt helyett az extracelluláris doménben, és csak 20 aminosavmaradék van a citoplazmatikus doménben. A markánsan rövid citoplazmatikus domén nem rendelkezik homológiával a többi kadherinnel, és a kadherin-17 adhéziós funkciója nem függ más citoplazmatikus fehérjékkel való asszociációtól. 7 A kadherin-17 szubcelluláris eloszlása ​​szintén eltér a klasszikus kadherinektől. A bélhámsejtekben az E-kadherin a tapadó csomópontokban koncentrálódik, míg a kadherin-17 egyenletesen oszlik el az oldalsó érintkezési területen. 8.

A kadherin-17 szöveti megoszlása ​​fajonként eltér. Patkányban a kadherin-17 a máj és a bél hámsejtjeiben expresszálódik. Emberekben és egerekben az expresszió csak a bél hámsejtjeire korlátozódik, és a májban nem található meg. A 17-cadherin korlátozott eloszlása ​​a normál szövetekben arra utal, hogy ez hasznos marker lehet a primer tumorhelyek azonosításához. Beszámoltak arról, hogy a kadherin-17 kolorektális, 10 gyomor-, 11, 12 és hasnyálmirigyrákban expresszálódik. 13 Nem ismert, hogy más szervek daganataiban fejeződik-e ki.

Következésképpen ebben a tanulmányban szövetmátrixok segítségével megvizsgáltuk a kadherin-17 expresszióját a test különböző helyeiből származó daganatokban. Megállapítottuk, hogy a cadherin-17 diffúzan és erőteljesen expresszálódott kolorektális adenokarcinómákban, szétszórtan expresszálódott a gyomor, a hasnyálmirigy és az epevezeték adenokarcinómáiban, és gyakorlatilag nem expresszálódott a test más részein található tumorokban. Vizsgálatunk azt jelzi, hogy a cadherin-17 hasznos marker lehet a metasztatikus adenokarcinómák elsődleges helyeinek azonosításához.

Anyagok és metódusok

Szövetminták

A tajvani Egyetem Nemzeti Kórháza Patológiai Tanszékének archívumából 518 korábban jellemzett primer karcinómából és 60 nem tumoros szövetből nyertek formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetblokkokat. A tanulmány az intézményi felülvizsgálati testület irányelveinek megfelelően készült. Ezek a daganatos esetek 44 emlőrákot, 39 méhnyakrákot, 33 kolangiokarcinómát, 47 vastagbélrákot, 57 májsejtes karcinómát, 50 tüdőrákot, 47 vesesejtes karcinómát, 89 petefészekrákot, 28 hasnyálmirigyrákot, 39 veserákot, prosztata- és 45 gyomorrákot tartalmaztak. rákos megbetegedések A nem tumoros szövetek spektrumát az 1. táblázat tartalmazza.

Teljes méretű asztal

Szövetmátrixok

A megcélzott szöveti területeket megjelöltük a H és E festett metszeteken, minden esetben 2 mm-es szövetmagot távolítottunk el kézi szövetmátrix eszközzel (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA), és egy receptor paraffin blokkba illesztettük. Az egyesített szöveteket 4 μm vastag szeletekre vágtuk, és pozitív töltésű tárgylemezekre helyeztük.

Western Blot elemzés

Western-blotokat végeztünk 11 reprezentatív normál- és daganatszövet fehérjebiztosító lizátumain, beleértve a vese, a máj, a vastagbél, a vékonybél, a gyomor, a lép, a pajzsmirigy, a hasnyálmirigy, a placenta, valamint a petefészek- és tüdőrákokat. Az egyes lizátumok hasonló mennyiségű összes fehérjét Tris-glicin-SDS-8% poliszkrilamid gélekkel (Novex, San Diego, Kalifornia, USA) elválasztottuk, majd Millipore-val átültettük az Impobilon-P polivinilidén-difluorid membránokra. A membránokat 1 egér monoklonális anti-cadherin-17 antitesttel, 1H3 (IgG1) klónnal vizsgáltuk 1 μg/ml koncentrációban (Abnova, Taipei, Tajvan), majd peroxidázzal konjugált kecske anti-egér immunglobulinnal (1: 2500). ). A Western blotokat kemilumineszcencia alkalmazásával fejlesztettük ki (Pierce, Rockford, IL, USA).

Immunhisztokémiai festés

A szövetszakaszokat paraffinmentesítettük és rehidratáltuk. Az antigén visszanyerését úgy végezzük, hogy a tárgylemezeket 0,01 M citromsav-pufferben (pH 6,0) 100 ° C-on 10 percig inkubáljuk. 3% H2O2 és 5% marhahús magzati szérummal történő blokkolás után a tárgylemezeket monoklonális antitesttel reagáltuk a cadherin-17 (1H3 klón, Abnova), a citokeratin 7 (DakoCytomation, Glostrup, Dánia), a citokeratin 20 (DakoCytomation) vagy a CDX ellen. -2 (Biogenix, San Ramon, Kalifornia, USA), 1: 100 hígítás mellett, 4 ° C-on, egy éjszakán át. A tárgylemezeket polimer-HRP reagenssel (BioGenex) inkubáltuk. A peroxidáz aktivitást diaminobenzidin-tetrahidroxi-klorid (BioGenex) oldatával tettük láthatóvá. A metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük. A sötétbarna hártyás festést pozitívnak, és egyetlen festést sem határoztuk meg negatívnak. Negatív kontrollok céljából az elsődleges antitestet 5% szarvasmarha-magzat szérummal helyettesítettük. A festést a következőképpen értékeltük: 0 (nem volt kimutatható festés); 1+ (75%). Pozitívan festő sejtekben a festés intenzív és egyenletes volt, ezért az intenzitást nem vettük figyelembe a pontszámban.

Eredmények

Először Western blot analízissel határoztuk meg az anti-cadherin-17 antitest (1H3 klón) specificitását. A kadherin-17 expressziót kizárólag a vékonybél és a vastagbél humán lizátumaiban detektálták, más normális szövetek és tumorok lizátumaiban nem (1. ábra). Az antitest specifikus volt a kadherin-17 fehérjére, mivel a vékonybél és a vastagbél lizátumaiban egyetlen sáv látszólagos molekulatömege körülbelül 110 kDa volt. Ez a sáv megfelelt a kadherin-17 fehérjének. A Western blot elemzésből kiderül, hogy nem volt kimutatható keresztreaktivitás más fehérjékkel.

A kadherin-17 fehérje Western-blot elemzése szöveti lizátumokban. Minden sávba azonos mennyiségű fehérjét (25 ug) töltöttünk. Ezen daganatok közül csak a vastagbél és a vékonybél szövete expresszálta a kadherin-17 fehérjét. A Cadherin-17 egyetlen sávnak tekinthető, amelynek molekulatömege 110 kDa.

Teljes méretű kép

Az 1. táblázat a kadherin-17 eloszlását mutatja a normál szövetekben immunhisztokémiai úton a szövetmátrix mintákban. A cadherin-17 erős diffúz membránfestését figyelték meg a bélhámban, beleértve a vékonybélből, a vakbélből és a vastagbél nyálkahártyájából vett mintákat (2a. És b. Ábra). A kadherin-17 a duodenum felszínes hámjában expresszálódott, Brunner mirigyében azonban nem. A kadherin-17 nem expresszálódott a normál gyomornyálkahártyában (2c. Ábra), de bélmetapláziás területeken figyelték meg. Semmilyen más szövettípusban nem volt kimutatható cadherin-17 expresszió (2d-f. Ábra).

A kadherin-17 immunhisztokémiai festése normál szövetben. A kadherin-17 expressziója a vastagbél hámsejtjeiben történt ( nak nek ) és a vékonybél ( b ), de nem a gyomor nyálkahártyájában ( c ), a máj ( d ), a tüdő ( és ) vagy a prosztata ( F ).

Teljes méretű kép

A 2. táblázat a test különböző helyszíneiről származó 518 daganat 17-cadherin immunhisztokémiai festésének eredményeit mutatja. A membrános kadherin-17 festés 47 (colorectalis) rák közül 45-ben (96%) volt jelen; A 47-ből 38-ban (81%) diffúz festés mutatkozott (> 75%) (3a. Ábra). A kadherin-17 45 gyomor adenokarcinómában 25-ben (56%), 28 hasnyálmirigy-adenokarcinómában 16-ban (57%) és 33 kolangiokarcinómában 9-ben (27%) is kifejeződött (3b-d. Ábra). A gyomor-, hasnyálmirigy- és epeúti adenokarcinómák többsége (42 az 50-ből, 84%) fokális vagy szétszórt festési mintázatot mutatott. A kadherin-17 ritkán expresszálódott a test más helyeiről származó daganatokban (3e. És f. Ábra). A vizsgált 331 daganat közül a cadherin-17 csak 1-ben (0,3%) expresszálódott, egy prosztata adenokarcinómában.

Teljes méretű asztal

A kadherin-17 immunhisztokémiai festése a tumorszövetben. A Cadherin 17 kolorektális adenokarcinómában expresszálódott ( nak nek ), Gyomor adenocarcinoma ( b ), hasnyálmirigy ductalis adenocarcinoma ( c ) és kolangiocarcinoma ( d ), de tüdő adenokarcinómában ( és ) vagy prosztata ( F ).

Teljes méretű kép

Teljes méretű asztal

A kadherin-17 és a citokeratin 7 expressziója kolorektális, gyomor és hasnyálmirigy adenokarcinómában. ( nak nek, b ) Egy cadherin-17 pozitív colorectalis adenocarcinoma ( nak nek ) és negatív a citokeratin 7 esetében ( b ). ( c, d ) Kadherin-17 pozitív gyomor adenokarcinóma ( c ) és citokeratin 7 ( d ). ( és, F ) Cadherin-17 pozitív hasnyálmirigy-adenokarcinóma ( és ) és citokeratin 7 ( F ).

Teljes méretű kép

Vita

Az ismeretlen elsődleges hely adenocarcinoma az egyik leggyakoribb klinikai probléma. A hét leggyakoribb elsődleges hely az emlő, a vastagbél, a tüdő, a petefészek, a hasnyálmirigy, a prosztata és a gyomor. 15 Mivel a különböző helyekről származó metasztatikus adenokarcinómák hasonló mikroszkópos megjelenéssel bírhatnak, az elsődleges hely azonosítása nehéz. Számos immunhisztokémiai markert azonosítottak a szövettani diagnózis elősegítésére, többek között a citokeratin 7, a citokeratin 20, a pajzsmirigy transzkripciós faktor 1, a CDX2, a prosztata specifikus antigén és a mezothelin. 3, 4, 15 A GI adenokarcinóma nagyon specifikus markere azonban még mindig hiányzik.

A kadherin-17 egy adhéziós fehérje, amelyet normálisan csak a bél hámja expresszál. Ez a rendkívül specifikus lokalizáció a 17-cadherint az immunhisztokémiai diagnózis potenciális eszközévé teszi. Eredményeink azt mutatják, hogy a kadherin-17 expressziója nagyon gyakori a colorectalis adenokarcinómákban, és a gyomor- és hasnyálmirigy-adenokarcinómák több mint felében, valamint kevés kolangiokarcinómában is kifejeződik. Kifejezése nem korlátozódik a bél metapláziában szenvedő tumorokra. Ezenkívül a cadherin-17 expressziója nagyon ritka a gyomor-bél traktuson kívüli karcinómákban. Ezek a megfigyelések a 17-cadherint hasznos markerré teszik az ismeretlen elsődleges hely adenokarcinóma szövettani diagnózisában.

A kolorektális daganatok további megkülönböztetéséhez a felső gasztrointesztinális traktusból származó daganatoktól két megközelítést alkalmaztunk. A kolorektális adenokarcinómában a kadherin-17 expressziója általában diffúz és erős volt, míg a felső emésztőrendszeri adenokarcinómákban általában fokális vagy szétszórt. A másik megközelítésünk a citokeratin 7 immunfestése volt. A citokeratin 7 immunreaktivitása a test legtöbb helyének adenokarcinómájában volt megfigyelhető, korlátozva annak klinikai alkalmazását. A cadherin-17/citokeratin 7 két marker profilozása azonban nagymértékben csökkentette a jelölt elsődleges helyet. Adatkészletünkben a 38 cadherin-17 (+)/citokeratin 7 (-) tumor közül 38 (97,3%) kolorektális adenokarcinóma volt. A másik egy gyomor adenocarcinoma volt. Az 56 közül 49 (86,0%) cadherin-17 (+)/citokeratin 7 (+) daganat gyomor-, hasnyálmirigy- vagy epeúti adenokarcinóma, 6 kolorektális adenokarcinóma és 1 prosztata adenokarcinóma volt. Ezért a cadherin-17/citokeratin 7 profil nagy specifitással meg tudja különböztetni a felső és az alsó gyomor-bél traktus adenokarcinómáját.

Szöveteinkben a cadherin-17 a colorectalis adenokarcinómák több mint 95% -ában expresszálódott. A cadherin-17 két immunonegatív esetének egyike megfelelt a nagy sejtek minimálisan differenciált vastagbélrákjainak kritériumainak, 16 olyan daganat, amelyet a mirigy differenciálódásának elvesztése és a mikroszatellit instabilitása jellemez. A másik egy adenosquamous carcinoma volt. A kadherin-17 csak a gyomor- és hasnyálmirigy-adenokarcinómák alig több mint felében és a kolangiokarcinómák 27% -ában expresszálódott. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a cadherin-17 (-) adenokarcinóma valószínűleg nem vastagbél-végbél adenokarcinóma, de nem zárható ki teljesen annak a lehetősége, hogy a gyomorból, a hasnyálmirigyből és az epeutakból származik.

A szövetkészletünkben használt szövetmintákat az elsődleges daganatos helyekről nyertük. Még tisztázandó, hogy a 17-kadherin megtartotta-e hasznosságát áttétes daganatokban. A gyomorrákban a cadherin-17 expresszió szignifikánsan gyakoribb volt az előrehaladott stádiumú esetekben, 11 de hasnyálmirigy- és kolorektális rákban a cadherin-17 gyakoribb volt jól differenciált 10, 13 daganatokban, nyirokcsomó-metasztázisok nélkül, nyirokerek. Érdemes lenne további metasztatikus rákos biopsziás mintákkal további vizsgálatokat végezni.