befolyásolja

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • A lárva étrend befolyásolja a szúnyogok fejlődését, fiziológiáját és megengedhetőségét, amikor Plasmodium
  • A lárva étrend befolyásolja a lárvák és a kifejlett szúnyogok mikrobiotáját
  • Vita
  • Mód
  • Etikai nyilatkozat
  • Szúnyogtelep és karbantartás
  • Lárva etetés
  • Lárva hosszmérések
  • Szárnyhossz mérések
  • Mikrobiota és gén expresszió elemzése
  • Által okozott fertőzések Plasmodium
  • Statisztika
  • további információ
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő ábrák és az 1. táblázat
  • Hozzászólások

Tárgyak

  • Fertőző betegségek
  • Mikrobiom
  • Nem modell szervezetek

Összegzés

Bevezetés

A világ népességének körülbelül felét fenyegeti a malária fertőzésének kockázata, amelyet a protozoon Plasmodium 1 paraziták okozta fertőzés okoz. Az emberi malária a fertőzött nőstény Anopheles szúnyogok harapásain keresztül terjed. Az Anopheles gambiae és az A. coluzzii a fő vektor a Plasmodium falciparum maláriában Afrikában, ahol a malária okozta halálozások 88% -a 2015-ben következett be 1. Ha a nőstény szúnyogok fertőző vérlisztben fogyasztják el, a Plasmodium paraziták nemi szaporodáson mennek keresztül a bél lumenében, majd áthaladnak a peritrofikus membránon és a bélhámban, és a bazális réteg elérésekor oocisztákká differenciálódnak. A következő egy-két hétben az oociszták belső mitotikus osztódáson és érésen mennek keresztül, amíg meg nem szakadnak, több ezer parazitát szabadítanak fel, amelyek a nyálmirigyekbe vándorolnak, és szúnyogcsípéssel átvihetők az emberi gazdaszervezetbe.

Az oociszta szakasz kritikus szűk keresztmetszetet jelent a paraziták fejlődésében, meghatározva, hogy a szúnyog megöli-e a parazitát, vagy továbbadja-e a maláriát. A parazita fertőzés sikere az egyes szúnyogok genetikai és nem genetikai jellemzőitől függ. Először is, a szúnyog mérete befolyásolja a bevitt vér mennyiségét, ezért a bevitt paraziták mennyiségét 3. Továbbá az NF-KB (Imd) immunhiányos út és a Thioester-protein 1 út (TEP1) kiegészítik a parazitákat, amikor átlépik a hámot és érintkezésbe kerülnek a keringési rendszerrel, illetve 2, 4, 5 6. Végül a szúnyog közepes bél baktériumközössége 24 órán belül drámai módon szaporodik a vér bevétele után, és negatívan befolyásolja a plazmodium fejlődését azáltal, hogy immunválaszokat vált ki és reaktív oxigénfajtákat szintetizál 6, 7, 8, 9. A mikrobiota összetétele szintén befolyásolhatja és/vagy szabályozhatja a Plasmodiumot, amint azt az Enterobacteriaceae arányának pozitív korrelációja sugározza sikeres Plasmodium 10 fertőzéssel .

Laboratóriumi körülmények között feltételezzük, hogy a lárvák táplálkozásának és a környezetnek ilyen hatásai nevelési körülményekké, pontosabban lárvák étrendjévé válhatnak, amelyek befolyásolják a lárvák és a kifejlett szúnyogok biológiáját. Mivel az étrend köztudottan befolyásolja a 23., 24. metazoan mikrobiotájának összetételét, különösképpen arra voltunk kíváncsiak, hogy megvizsgáljuk, hogy ez befolyásolja-e a kolonizált szúnyogok mikrobiotáját, és ezért potenciálisan hozzájárulhat-e a mikrobiota összetételének nagy különbségéhez a 10., 25., 26. laboratórium között. 27. Ebben a tanulmányban elemezzük a lárva étrend hatását az A. coluzzii vektor fejlődésére, mikrobiotájára és versenyére. Összpontosítva három, a rovarokban általában alkalmazott étrendre, megmutatjuk, hogy ezek a diéták eltérően befolyásolják a lárva fejlődésének sebességét, a kifejlett szúnyogok méretét, valamint a lárva és a felnőtt mikrobiotát. A lárvák étrendje jelentősen befolyásolja a P. berghei fertőzés prevalenciáját és intenzitását is, valószínűleg mikrobiotától függő mechanizmussal.

Eredmények

A lárva étrend befolyásolja a szúnyog fejlődését, a Plasmodium fiziológiáját és megengedhetőségét

( nak nek ) A lárvák hossza a három lárva-étrend egyikének etetésének 7. napján: Tetramin halpehely (FF), Dr. Clarke medence granulátum (D) vagy Nishikoi hal granulátum (FP). ( b ) Az egyes étrendekhez tartozó átlagos lárvák költésig tartása az etetés első napjától számítva. ( c ) A felnőtt szárnyak hossza a lárvák táplálkozása után a három lárva-étrendben. Az adatok 3 független kísérlet átlagát mutatják ± sem, a statisztikai elemzések pedig ANOVA-k az előző modell kiigazítását követően. *** o

Teljes méretű kép

A lárva étrend befolyásolja a lárvák és a kifejlett szúnyogok mikrobiotáját

Összefoglalva, eredményeink új betekintést nyújtanak a lárvák étrendjének a szúnyogfejlődésre, a mikrobiotára és a malária parazitákra való megengedésre gyakorolt ​​hatására. Műszaki érdeklődéssel bírnak a szúnyognevelés iránt is, bizonyítva, hogy gyorsabb fejlődés érhető el a granulált D és FP diéták alkalmazásakor, és hogy az FP szúnyogokat termel magasabb Plasmodium fertőzéssel. .

Mód

Etikai nyilatkozat

Az állatok felhasználását az Egyesült Királyság Állatainak (Scientific Procedures) 1986. évi törvényével összhangban hajtották végre. A parazitákkal fertőzött egerek vérellátásával a szúnyogok P. berghei-vel történő fertőzésére vonatkozó protokollt az Egyesült Királyság PPL70/7185 számú engedélyével bocsátották ki. 2010. január. Az eljárások enyhe vagy közepesen súlyosak, és a felhasznált állatok számát a leggazdaságosabb protokollok beépítésével minimalizálják. A protokollokat a császári főiskola etikai felülvizsgálati bizottságának jóváhagyása után hajtották végre.

Szúnyogtelep és karbantartás

Kísérleti munkát végeztek a 2006-ban létrehozott An. Coluzzii Ngousso kolóniában Kamerun területén gyűjtött szúnyogokból, amelyeket emberi vérben tartottak 27 ° C-on és 70% -os páratartalom mellett, 12 óra: 12 órás fényciklus/sötétség mellett. A kifejlett szúnyogokat 5% -os fruktózoldattal etettük, és a lárvákat desztillált vízben tartottuk. Az étrendi kezelésekhez előállított lárvák generációit a Tetra FF-et őröltük 1-2 mm-es töredékekre, a kontroll étrendet ebben a vizsgálatban alkalmaztuk. A bábokat naponta összegyűjtötték, desztillált vízzel ellátott üvegpoharakba tették, és ketrecbe helyezték őket.

Lárva etetés

Minden étrendkezeléshez 400 (± 10%) 48 órás életkor etetés nélkül Az első instar coluzzii lárvákat manuálisan vagy COPAS lárvaszortálóval (Union Biometrica, USA) számoltuk meg, és műanyag tálcába helyeztük. Mindegyik lárva tálcát a három hagyományos halalapú étrend egyikével táplálták: Tetra Tetramin Halpehely („FF”), Dr. Clarke medencepellete („D”) és Nishikoi Hal Pellet („FP”). Ezen étrendek táplálkozási összefoglalásait a 2. táblázat mutatja. Amint a 2. táblázatban közöltük, az étrendeket olyan mennyiségben szállítottuk, amely összehasonlítható táplálék-alkotóelemeket biztosít az egyes élelmiszerekben. Az FF-eket enyhén összekeverték a pelyhek méretének csökkentése érdekében, ahogy laboratóriumunkban általában használják a lárvák nevelésére.

Teljes méretű asztal

Lárva hosszmérések

Kilenc napos lárvákat (a tojásgyűjtés idejéből) gyűjtöttünk minden egyes kezelésből 3 független kísérletből, és egy 96 üreges lemez egyes lyukaiba helyeztük 20x nagyítású képalkotás céljából. A teljes testhosszt a fej tetejétől a has hegyéig mérték a Fidzsi 41-el .

Szárnyhossz mérések

Minden kezelésből húsz felnőttet gyűjtöttünk össze 4 független kísérletből. Egy-egy szárnyat eltávolítottak egyenként, és egy papírlapra ragasztottak. A papír beolvasása után a szárnyhosszakat Fidzsi 41-gyel mértük meg .

Mikrobiota és gén expresszió elemzése

Húsz egyedet (9 napos lárvákat, nőstényeket 3-5 nappal a vérzés előtt vagy 24 órával a vér után) gyűjtöttünk minden kezelésből 4 független kísérletből, szuszpendáltuk 70% -os etanolban 3-5 percig, majd háromszor mostuk PBS-ben mint 25 felett. A kifejlett beleket és petefészkeket boncoltuk, és mintát vettünk két, 10 szövetből álló csoportban. A csipeszeket és a tárgylemezeket desztillált vízzel és etanollal tisztítottuk az egyes minták között. Az élelmiszerekben található baktériumok mennyiségi meghatározásához napi tápmennyiséget (d7 +) homogenizáltunk 5 ml steril vízben, majd 1 ml mintát vettünk, 800 g-on 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszót eldobtuk. Minden diétánál 4 ismétlést figyeltünk meg. Az RNS mennyiségének normalizálása érdekében az 175 cm2-es lombik összefolyó tenyészetéből származó Sf9 sejtek szuszpenzióját felosztottuk a 12 mintára.

Az RNS-t teljes lárvákból, kifejlett szövetekből és granulált víztartalomból Trizollal és kloroformmal extraháltuk, izopropanollal kicsaptuk, és kétszer 70% -os etanollal mostuk. A reverz transzkripciót (Takara) PrimeScript RT Enzyme Mix I alkalmazásával 650 ng RNS-sel végeztük a gyártó utasításainak betartásával. A bakteriális 16S rRNS gént qRT-PCR-rel alkalmaztuk kvantifikálásra egy LightCycler 480-on (Roche), SYBR Premix Ex Taq kit (Takara) felhasználásával, a gyártó utasításainak betartásával. A baktériumok terhelését és összetételét az összes baktériumra vonatkozó általános 16S rRNS gén-primerek alkalmazásával értékeltük, és specifikusak azokra a baktériumcsaládokra, amelyekről ismert, hogy kolonizálják a szúnyogokat a rovarokban (S1. Táblázat és 25. hivatkozás). A baktériumterhelést és a vitellogenin expressziót a célgén és az S7 (S7) 40S Anopheles gén riboszomális fehérjéjének arányaként mutatjuk be, míg az élelmiszerek baktériumterhelését a GAPDH (gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz) háztartási gén arányaként számszerűsítettük. az Sf9 sejtekben.

Plasmodium fertőzések

Egy 8-12 hetes nőstény CD1 egeret intraperitoneálisan injektáltunk 100 ul P. berghei 5O7 fertőzött vérrel, és két napig tartottuk a parazita növekedés és a gametocyta differenciálódás lehetővé tétele érdekében. Miután ellenőrizte, hogy a parazitaemia 3 és 8% között van-e, az egeret intramuszkulárisan 4 µl-vel injektálták. g -1 érzéstelenítő oldatot (Rompun 0,33%, ketamin 33 mg mL -1 -1 PBS-ben), és három csésze szúnyogot 5-10 perc elteltével adtak vérrel. A szúnyogokat 12 napig 20 ° C-on tartottuk, hogy a parazita fejlődhessen az oociszta szakaszáig. Ezután az elhullott szúnyogokat eltávolítottuk és pontoztuk, majd az összes túlélő szúnyogot fluoreszcens mikroszkóppal boncoltuk fel oocisztaszámban. Minden kísérlethez állapotonként legalább 50 szúnyognak kínáltak vérlisztet, és 24 órával később meg nem öltött szúnyogokat öltek meg. Átlagosan 36 (± 3,6 fél) szúnyog oocisztáját számoltuk meg állapotonként és kísérletenként. Az átlagos intenzitás és prevalencia különbségeit a szöveg az egyes replikák hatásának átlagaként említi; azaz (adatok (teszt étrend) - adatok (kontroll étrend))/adatok (kontroll étrend).

Statisztika

A statisztikai elemzéseket általánosított lineáris vegyes modellekkel (GLMM) végeztük R-ben (3.2.3 változat). ANOVA tesztet hajtottak végre x 2 logisztikai regresszióban (glmer) faktoriális adatokkal (prevalencia, túlélés). Wald Z tesztet hajtottak végre nulla felfújt negatív binomiális regresszión (glmmADMB) oocisztaszámlálás céljából. ANOVA tesztet hajtottak végre x 2 egy közös lineáris regresszióban (lmer) a qPCR adatokon (16S, génexpresszió), a lárva hosszán, a bábozás idején és a szárny hosszán. A GLMM elemzi az adatok bontását fix komponensre (itt lárva diéták) és véletlenszerű komponensre (itt replikálják a kísérleteket). A 2. ábrán bemutatott esélyek arányai a regressziós együtthatók exponenciális értékei. A minta méretét standard protokollok (oocisztaszám, génexpresszió, mikrobiota elemzés) alapján választottuk, vagy a szúnyognevelési tapasztalatok (lárvák fejlődése) alapján becsültük meg. A szúnyogokat kizártuk, ha nem táplálkoztak vérrel, felszakadtak a boncolás során (mikrobiota elemzés, génexpresszió), vagy ha a kísérlet során elhaltak (lárvaként vagy felnőttként).

további információ

Belépési kódok: A jelen tanulmányban említett gének Vectorbase csatlakozási száma (www.vectorbase.org) a következő: AgS7 - AGAP010592; Vitellogenin - AGAP004203.

Hogyan lehet idézni ezt a cikket: Linenberg, I. és mtsai. A lárva étrend befolyásolja a szúnyogok fejlődését és a Plasmodium fertőzés megengedhetőségét. Sci. Rep. 6., 38230; doi: 10.1038/srep38230 (2016).

A szerkesztő megjegyzése: A Springer Nature semleges marad a közzétett térképekkel és intézményi kapcsolatokkal kapcsolatos joghatósági igényekkel szemben.

Kiegészítő információk

PDF fájlok

Kiegészítő ábrák és az 1. táblázat

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja a közösségi feltételeket és irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.