Granadai Egyetem Biotechnológiai Intézet Irányított kutatómunka a cím megszerzéséhez: Master in Biotechnology A Bacillus pumilus entomopatogén törzsének fehérje profiljának jellemzése. Diana Carolina García Ramón 2011. július

törzs

Granadai Egyetem Biotechnológiai Intézet Irányított kutatómunka a cím megszerzéséhez: Biotechnológiai mester A Bacillus pumilus entomopatogén törzsének fehérje profiljának jellemzése. Diana Carolina García Ramón 2011. július Oktató: Társoktató: Dra. Susana Vílchez Tornero Felvett professzor Orvos Biokémiai Tanszék Granadai Biotechnológiai Intézet Dr. Antonio Osuna Carrillo de Albornoz professzor Granadai Egyetem Parazitológiai Tanszék Granadai Egyetem

E kutatási munka egy részét az IOBC/WPRS munkacsoportok kongresszusának 13. európai találkozóján mutattuk be szóbeli előadással, melynek címe: A Bacillus pumilus 15.1 toxicitásának megértése a mediterrán gyümölcslégy (Ceratitis capitata) felé. Helyszín: Innsbruck Austria Dátum: 2011. június 19–23

MUTATÓI KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS. I MUTATÓ. V. ÖSSZEFOGLALÓ. 1 RÖVIDÍTÉSEK. 5 1. BEVEZETÉS. 9 1.1 Entomopatogén mikroorganizmusok. 11 1.2 Entomopatogén baktériumok. 13 1.2.1 A Bacillus nemzetség. 14 1.2.2 Bacillus thuringiensis. 15 1.2.2.1 Virulencia tényezők: Cry és Cyt toxinok. 17 1.2.2.2 Egyéb virulencia faktorok. 19 1.2.2.3 Biotechnológiai alkalmazások. 21 1.3 Bacillus pumilus. 22 1.3.1 Biológia. 22 1.3.2 Biotechnológiai alkalmazások. 24 1.3.2.1. Enzimtermelés. 24 1.3.2.2 Antibiotikumok előállítása. 26 1.3.2.3 Biológiai ellenőrzés. 27 1.3.2.3.1. A gombák és baktériumok védelme a növényekben. 27 1.3.2.3.2 Rovarirtás. 30 1.3.2.4 Egyéb alkalmazások. 32 1.4 Bacillus pumilus 15.1. 32 2. CÉLOK. 37 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK. 43 3.1 Baktériumtörzsek tenyésztési körülményei. 45 3.1.1 Baktériumtörzsek és megőrzésük. 45 3.1.2 Táptalajok. 46 3.1.2.1 Gazdag közeg. 46 3.1.2.2 Sporulációs közeg. 46 3.1.3 Növekedési körülmények. 47 3.2 Fehérjeelemzés. 47 3.2.1 Fehérje minták kezelése. 47 3.2.2 Fehérje-elektroforézis. SDS-PAGE. 49 3.2.3 A fehérjék elválasztása szacharózgradienssel. 50 3.2.4 Mikroszkópia. 51 3.2.4.1. Optikai mikroszkópia. 51 3.2.4.2 Transzmissziós elektronmikroszkópia. 52 3.2.5 Immunblotok. 52 3.2.6 Fehérje szolubilizáció. 54.

3.2.7 A fehérjék elemzése és azonosítása a MALDI-TOF segítségével. 56 3.2.8 Biológiai vizsgálatok C. capitata-val. 56 3.2.8.1 A mediterrán gyümölcslégy telep fenntartása. 56 3.2.8.2. Lárvákkal végzett biológiai vizsgálatok. 58 4. EREDMÉNYEK. 63 4.1 A B. pumilus törzs fehérje profilja 15.1. 65 4.1.1 A vegetatív növény fehérje profilja. 66 4.1.2 Sporulált tenyészet fehérje profilja. 67 4.2 Fehérjeszeparáció szacharózgradiensekkel. 70 4.3 A B. pumilus 15.1 megfigyelése mikroszkóppal. 79 4.4 A B. pumilus 15.1 tenyészet frakcióinak elemzése Immunoblot alkalmazásával. 85 4.5 Fehérje oldhatóság. 88 4.6 A fehérjék azonosítása peptid lábnyomelemzéssel vagy ujjnyomással. 92 4.7 Az izolált fehérjék aktivitása szacharózgradiensekben a C. capitata lárvákkal szemben. 95 5. MEGBESZÉLÉS. 99 6. KÖVETKEZTETÉSEK. 109 7. JÖVŐBENI MUNKA. 115 8. BIBLIOGRÁFIA. 121 MELLÉKLETEK. 141 A fehérjék elemzése és azonosítása a MALDI-TOF segítségével. 143 37 kda fehérje. 143 Fehérje 17 kda. 144 Fehérje 45 kda. 145 Fehérje 60 kda. 146 Fehérje 250 kda. 147

RÖVIDÍTÉSEK (p/p) Súly/tömeg arány (p/v) Súly/térfogat arány (v/v) Térfogat/térfogat arány

Hozzávetőleges C fok Celsius µg Mikrogramm µl Mikro liter µm Mikrométer 16S Prokarióta riboszóma kisebb alegység rRNS molekula DNS Deoxiribonukleinsav APS Ammónium perszulfát RNS Ribonukleinsav rRNS riboszomális RNS ATP Adenozin trifoszfát Bturingin Bt protein Ct. Citolitfehérje Da Daltons DNSse Dezoxiribonukleáz DTT Ditriotreitol EDTA Etilén-diamin-tetraecetsav g Gramm H 2 O 2 Hidrogén-peroxid HCl Sósav K 2 MnO 4 Kálium-manganát kb Kilo bázisok 5

kda LM ma mg ml mm mm MS - MS PBS ph PMSF RNáz fordulat/perc SDS SDS-PAGE TEMED CFU V Vh W xg Kilo Daltons liter Moláris koncentráció Milli amper Milli gramm Milli liter Milli méter Milli Molar Peptiddarabolás módszere tömegspektrometriában Puffer Sóoldat-foszfát Hidrogénpotenciál Fenil-metilszulfonil-fluorid Ribonukleáz Források percenként Nátrium-dodecil-szulfát

1. BEVEZETÉS 9

Bevezetés ABCDEFF 1.1. Ábra A paraszporális kristályok különböző morfológiája: romboid (A), dipiramidális (B), heterogén (C) (Kaelin és mtsai 1994), gömb alakú (D), szabálytalan (E) (Karamanlidou és mtsai 1991) és köbös (F) (Ramalakshmi és Udayasuriyan 2010). 1.2.2.1 Virulencia tényezők: Cry és Cyt toxinok A δ-endotoxin csoport két olyan fehérje csoportból áll, amelyek nem rendelkeznek egymással szekvenciával vagy harmadlagos szerkezettel: a Cry fehérjék (az English Crystal-ból) és a Cyt fehérjék ( az angol Cytolitic-ból). A mai napig 572 különböző kiáltó gént és 35 cit gént klónoztak és szekvenáltak (Crickmore et al. 2011). Mindegyik δ-endotoxin jellegzetes inszekticid hatásspektrummal rendelkezik, hatásának tartománya néhány fajra korlátozódik, általában azonos sorrendben. Ez a spektrum függhet a törzs által termelt δ-endotoxin kombinációjától. Nagyszámú δ-endotoxin gén kombinációt írtak le, a legtöbb 17

azonos jellemzőkkel rendelkezik a B. pumilus T4, amely az Arabidopsis-ban rezisztenciát vált ki a Pseudomona syringae ellen (Ryu és mtsai 2003). A B. pumilus egyes törzseinek hatásmechanizmusa a növényekben rezisztencia-rendszerek kiváltására meglehetősen jól ismert. Például a cukorrépában a B. pumilus 203-6 és 203-7 szisztémás rezisztenciát vált ki a kitináz és a β-1,3-glükanáz termelésének növelésével (Bargabus és mtsai 2004); A dohányban a B. pumilus SE34 által közvetített rezisztenciát a megnövekedett szalicilsavszint határozza meg (Zhang és mtsai. 2002), míg a borsóban ugyanez a törzs rezisztenciát vált ki az epidermális sejtfalak megerősítésével és a kortikális kallóz és fenol termelésével. vegyületek (Choudhary és Johri 2009). Így a növényekben a B. pumilus szisztémás rezisztenciájának indukciója, hasonlóan fajához, a baktérium törzsétől, a gazdanövénytől és egyes esetekben a kórokozótól függ (Choudhary és Johri 2009). Számos példát írtak le az irodalomban (1.2. Táblázat). Ezt az alkalmazást iparilag kihasználták, és számos olyan termék eladó, amelyek hatóanyaga a B. pumilus törzse (1.3. Táblázat). 28.

Bevezetés 1.2. Táblázat: B. pumilus alkalmazása növényi kórokozók biológiai szabályozására. A Cacospora Cercospora beticola SE34 és a T4 dohánykék penész Peronospora hyoscyami pv. Bacillus pumilus törzs Növényi betegség patogén 203-6 és 203-7 cukorrépa levélfolt. tabacina INR7 Uborka Baktériumok hervadása Erwinia tracheiphila SE34 Paradicsomlevél folt Uborka mozaikvírus (CMv) SE34 Paradicsom Késő gyulladás Phytophthora infestans INR7, SE34, SE39, SE52 Frankincense fenyő Fusiform rozsda Cronartium quercuum, Miyabe exsirai. sp. Fusiform INR7 Uborka szögletes folt Pseudomona syringae SE34 Tomato Leaf spot T4 Tobacco Wildfire Paradicsom foltos vírus (ToMov) Pseudomona syringae pv. dohányforrás: (Choudhary és Johri 2009). 29.

1.3. Táblázat: A növények biológiai védekezésére szolgáló, B. pumilus márkanév/terméknév B. pumilus törzs Kórokozó/betegség GB34 Biológiai gombaölő szer GB34 Rhizoctonia és Fusarium Ballad QST2808 Ázsia szójarozsda Sonata B. pumilus Lisztharmat, penész, Cercospora levélfoltosság, korai, késői, barna rothadás, tűzvész. Hozampajzs GB34 Gyökérbetegséget okozó kórokozó gombák. Forrás: APS Biológiai Védelmi Bizottság (http://www.oardc.ohio-state.edu/apsbcc/) 1.3.2.3.2 Rovarirtás Hagyományosan a B. pumilus nem tekinthető entomopatogén fajnak. A bizonyított hasznos biológiai tevékenységek sokfélesége ellenére alkalmazásai a bioplagicidek alkalmazására összpontosítottak a fitopatogén gombák által okozott betegségek megelőzésére és kezelésére, főként bizonyos növények gyökereiben. A vizsgálatok azonban kimutatták a B. pumilus törzsek patogenitását a célrovarokkal szemben (Heins és mtsai 1999; Eryurk és mtsai 2008; Molina és mtsai 2010; Yaman és mtsai 2010). 30

Bevezetés 1999-ben Heins és munkatársai szabadalmaztattak egy módszert a növények kukorica gyökérféreg (Diabrotica virgifera, D. longicornis, D. undecimpunctata), a zöld fánk vagy répaféreg (Spodoptera exigua) és egyes fonalférgek elleni védelemre bizonyos mennyiségű felülúszó, amelyet a B. pumilus AQ717 teljes tenyészetéből nyernek a növény bármely részén, beleértve a gyökereket vagy a környező talajra történő alkalmazást is. Az említett szabadalom magában foglalja a B. pumilus AQ717 törzset, a törzs által termelt peszticid aktivitású metabolitokat, valamint a növények ezen rovarok elleni védelmére és kezelésére szolgáló különféle módszereket, akár a baktériumtenyészet szuszpenziójának, akár a tenyészet felülúszójának vagy a tisztított metabolitnak a felhasználásával. A szabadalom kis molekulatömegű oldható és toxikus metabolit (