terápiás

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • A KCNQ csatornák retigabin modulációja egy Trp S5 segítségével
  • A KCNQ3 csatornák természetellenes aminosav-mutagenezise
  • A retigabin hatások elvesztése a Trp265 H kötés eltávolítása után
  • A Trp265-retigabin kölcsönhatás erősségének finomhangolása
  • A feltételezett gyógyszerkötő maradékok relatív hozzájárulása.
  • Valószínű H-kötő donor azonosítása retigabinban
  • Vita
  • Mód
  • Molekuláris biológia és in vivo ostobaság elnyomása
  • Kételektródás feszültségbilincs felvételek
  • A retigabin megkötésének molekuláris szimulációi
  • Adatelemzés
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő információk
  • Hozzászólások

Tárgyak

  • Ion csatornák
  • Membránfehérjék
  • Molekuláris biofizika

Összegzés

Bevezetés

Az epilepszia gyakori, heterogén és gyakran gyengítő rendellenesség, amely a világ népességének körülbelül 1% -át érinti. Az epilepsziában szenvedő betegek jelenlegi klinikai kezelése főként gyógyszeres kezeléssel történik, bár általánosan elfogadott vélemény, hogy az újonnan diagnosztizált epilepsziás betegek ∼ 30% -a rezisztens lesz a szokásos 1, 2 antikonvulzív szerekkel szemben. Ezenkívül az említett ellenállás összefügg a támadás típusával; például arról számoltak be, hogy a fokális epilepsziában szenvedő betegek 60% -ánál kialakul és fenntartódik a gyógyszerrezisztencia 3. Ezek a hiányosságok motiválták az új epilepsziaellenes gyógyszerek keresését, az epilepszia rendhagyó kezeléseit (például a ketogén diéta), valamint az új farmakológiai célok folyamatos azonosítását és validálását 4, 5, 6, 7 .

Természetellenes aminosav-mutagenezist alkalmaztunk az atomok és az elektronok finoman átrendezésére a Trp oldalláncon a retigabin kötési helyén. Megállapításaink azt mutatják, hogy a KCNQ3 Trp265 indol-nitrogénatomjának újrapozícionálása teljesen megszünteti a retigabin hatásait, ami arra utal, hogy a retigabin kölcsönhatásához H-kötés szükséges a Trp265-tel. Ennek a H-kötés kölcsönhatásnak a fontosságát tovább szemlélteti a fluorozott Trp-analógok bevezetése (nagyobb hajlandósággal a H-kötésekre) a KCNQ3 Trp265-be, ami megnöveli a gyógyszer hatékonyságát. Több retigabin analóg felhasználásával azonosítottunk egy elektrosztatikus ujjlenyomatot egy H-kötés akceptor körül, amely korrelál a gyógyszer hatékonyságával. Ezek a kísérleti korlátok meghatározzák a retigabin kölcsönhatásaiban részt vevő specifikus atomokat és kémiai erőket, és kiemelik azokat a megközelítéseket, amelyek felhasználhatók a meglévő gyógyszerek racionális fejlesztésének irányításához.

Eredmények

A KCNQ csatornák retigabin modulációja egy Trp S5 segítségével

( nak nek, b ) Vezetőképesség-feszültség kapcsolatok ( nak nek ) KCNQ2 (n = 3) és KCNQ2 [Trp236Phe] (n = 6), és ( b ) KCNQ3 * (n = 5) és KCNQ3 * [Trp265Phe] (n = 3) homomer csatornák a jelzett mutánsokkal együtt (retigabin-koncentráció 100 µM). ( c ) KCNQ2 és KCNQ3 heteromer kombinációinak vezetőképesség-feszültség összefüggései (az injektált mRNS aránya 1: 1, Trp → Phe mutációkkal vagy anélkül, ahogyan jeleztük, n = 5 mindegyik kombinációhoz), csökkentett retigabin kötődésű csatornák létrehozására oldalak. ( d ) A 100 μM retigabin telítettség V 1/2 változásainak összefoglalása a KCNQ2 Trp236 és a KCNQ3 Trp265 mutációkban a jelzettek szerint (* P 19, 20 .

Kipróbáltuk, hogy a KCNQ3 Trp 265 pozíció szerepet játszik-e a PIP 2 csatornára adott válaszok szabályozásában. A PIP 2 hidrolizálásához a depolarizált feszültségekhez a feszültségérzékeny foszfatáz ciona zarnuis feszültségérzékeny foszfatáz (CiVSP) segítségével pulzáltuk a petesejteket egy előimpulzus feszültségtartományon keresztül, amelyet egy -20 mV tesztimpulzus követett, hogy értékeljük a csatorna aktivitását a PIP 2 kimerülése után 27 . Hasonló csatornacsökkenést figyeltünk meg a depolarizációs feszültség lépéseivel a KCNQ3 * és a KCNQ3 * [Trp265Phe] csatornákon, jelezve, hogy a Trp265 nem befolyásolja szignifikánsan az anionos foszfolipidek csatornaműködésre gyakorolt ​​hatását (1e., F. Ábra). Összességében ezek az eredmények azt illusztrálják, hogy a KCNQ3 Trp265 maradvány elengedhetetlen a retigabin hatásaihoz, de nem játszik jelentős szerepet a csatorna aktiválásának feszültség vagy PIP 2 általi szabályozásában. .

A KCNQ3 csatornák természetellenes aminosav-mutagenezise

A retigabin és a Trp ezen esszenciális mellékláncának kölcsönhatásainak mögöttes mechanizmusának vizsgálatához természetellenes aminosav-mutagenezist alkalmaztunk kissé megváltozott Trp-variánsok bevezetésére (2a. Ábra). Ezzel a módszerrel egy stop kodont (TAG) helyeznek az ioncsatorna génjébe egy érdekes helyen, és ezt az mRNS-t együtt injektálják a Xenopus laevis oocitákba egy szintetikus aminosav acilezett tRNS-sel együtt (amely nem aminosavat tartalmaz) ). természetes), amely merőleges a szintetikus Xenopus tRNS 28 útvonalakra. Amikor a riboszomális transzlációs gép találkozik a bevitt TAG stop kodonnal, a komplementer szintetikus tRNS (egy CUA antikodonnal) lehetővé teszi a hozzáadott aminosav leolvasását és beépítését teljes hosszúságú ioncsatornákba (2a. Ábra) 29 .

A retigabin hatások elvesztése a Trp265 H kötés eltávolítása után

A feltételezett gyógyszerkötő maradékok relatív hozzájárulása.

( nak nek ) Vezetési-feszültség viszonyokat gyűjtöttünk a jelzett KCNQ3 * mutáns csatornákhoz (n = 4-6 per mutáns) 0, 100 vagy 300 µM retigabinban. ( b ) ΔV 1/2 maximum 300 μM retigabinban, minden mutáns csatornában mérve. A hiba sávok vannak nak nek, b képviselje sem ( c ) A retigabint a KCNQ3 pórusképző doménjének molekuláris modelljéhez kapcsoltuk (lásd a 19. hivatkozást). Két orientáció látható a karbamátcsoporttal a Leu314 („eredeti” modell) vagy a Trp265 („flip” modell) közelében. A két kötési minta átfedésben van az „átfedésben”, megmutatva a mindkét gyógyszer-orientáció által elfoglalt hasonló helyet.

Teljes méretű kép

Valószínű H-kötő donor azonosítása retigabinban

Továbbá megvizsgáltuk a H-kötés mechanizmusát a Trp265-hez a potenciális H-kötés akceptorok felkutatásával a retigabin molekulán, ezt a feladatot számos retigabin analóg elérhetősége megkönnyíti. Először az ML-213 analógot vesszük figyelembe, mivel annak egyszerűbb kémiai kerete van a retigabinhoz képest, és csökkent a lehetséges H-kötés-akceptorok száma (6a, b ábra). Megállapítottuk, hogy az ML-213 a KCNQ3 * erőteljesebb aktivátora a retigabinhoz képest (EC 50 = 3,6 ± 0,2 μM, n = 5, szemben 11,6 ± 0,4 μM, n = 5, 6c ábra, ± jelzett) . A retigabin és az ML-213 kiszámított elektrosztatikus felületi potenciálját is belefoglaltuk, szemléltetve, hogy a karbonil-oxigén körüli negatív felületi potenciál kifejezettebb az ML-213 esetében (piros dudor, 6a, b ábra).

( nak nek, b ) A retigabin és az ML-213 kémiai szerkezete és elektrosztatikus felületi potenciálja. Vegye figyelembe az ML-213 karbonil-oxigénatom közelében bekövetkező negatív felületnövekedést. Az elektrosztatikus felületi potenciál ábrázolásának skálája piros: −80 kcal, sárga: 0 kcal, kék: +80 kcal. ( c ) Koncentráció-válasz görbék a retigabin és az ML-213 (n = 5) KCNQ3 * csatornákra gyakorolt ​​hatására (n = 5). A hibasávok szemet képviselnek

Teljes méretű kép

( nak nek ) Kémiai szerkezetek és elektrosztatikus felületi potenciálok retigabin-analógok sorozatához. Az összes struktúrát és a felületi potenciál térképeket a konzervált amid-észter kötés helye alapján igazítottuk; Figyelje meg a karbonil oxigénatom körüli negatív felületi potenciál intenzitási gradiensét (a skála megegyezik a 6. ábrán látható skálával). ( b ) Összegzés, amely bemutatja az egyes gyógyszerek EC50-értékét Trp-mentett KCNQ3 * [Trp265TAG] csatornákban, F3-Trp-mentett és Ind-mentett (n = 4-9 adatpontonként) és maximális hatékonyságot (ΔV 1/2) az F 3 -Trp és Trp megmentett csatornákban lévő egyes gyógyszerekből (az Ind megmentett csatornákra gyakorolt ​​hatás minimális, ezért ezeket kihagyták). A hibasávok szemet képviselnek

Teljes méretű kép

Vita

Jelenleg a retigabin az egyetlen olyan gyógyszer, amelyet széles körben engedélyeztek a klinikai használatra, és amely a feszültségtől függő káliumcsatornák aktiválásával hat. Ennek a gyógyszerprototípusnak a részletes vizsgálata elmélyítheti annak megértését, hogy a gyógyszerek miként működhetnek ioncsatorna-aktivátorként, és felgyorsíthatja a káliumcsatorna-aktivátorok fejlődését nagyobb hatékonysággal vagy specifitással. Ezek a gyógyszerek kiaknázatlan terápiás potenciállal bírhatnak az epilepszia mellett számos "túlzott izgatottság" rendellenesség kezelésében, mint például fájdalom-szindrómák, magas vérnyomás és szívritmuszavarok 9, 36. Ezenkívül a közelmúltbeli jelentések kiemelték a retigabin hatékonyságát a fülzúgás, a Parkinson-kór és a Huntington-kór kezelésében 37, 38, 39 .

Vizsgálatunk elején a retigabin-érzéketlen KCNQ1 csatornával végzett kiméra vizsgálatok azonosították a Trp-maradék (KCNQ3 Trp265) jelentőségét a pórusképző régióban, a citoplazmatikus csatorna feltételezett kapuja közelében. A retigabin interakcióját ezzel a hellyel általános hidrofób kölcsönhatásként ésszerűsítették ezzel a konzervált Trp-maradékkal (amely szintén jelen van a KCNQ2, 4 és 5-ben) 19, 20 .

Több KCNQ csatornanyitó szerkezetet mutatunk be, hogy kiemeljük a különféle gyűrűs szerkezetek által határolt amidcsoport általános jellemzőit. Eredményeink kiemelik az amid-karbonil fontosságát a KCNQ3 Trp 265-tel való kölcsönhatás szempontjából, valamint a KCNQ2, 4 és 5 valószínű ekvivalens pozícióit. A képviselt gyógyszerek ( nak nek ) retigabin, ( b ) ztz-240 (leírva a 24. hivatkozásban), ( c ) akrilamid (ok) -1, ( d ) BMS-204352 és ( és ) egy meg nem nevezett kísérleti gyógyszer, amelyet a ref. 43)

Teljes méretű kép

Egy utolsó figyelemre méltó részlet az, hogy bár eredményeink meghatározzák a retigabin és a KCNQ3 Trp265 (és a KCNQ2, 4, 5 analóg maradékai) kölcsönhatásának atomalapját, jelentős bizonyítékok vannak további interakciós helyekre, amelyek lehetővé teszik bizonyos KCNQ alegységek potencírozását. Például a vizsgált ICA-vegyületekről (és más rokon vegyületekről, például a ztz-240-ről), valamint a diklofenak-származékok családjáról beszámoltak, hogy a konzerválódott S5 Trp-maradéktól függetlenül befolyásolják a KCNQ2 csatornákat, és drámai módon erősebb hatást mutatnak a KCNQ2-re. viszony a KCNQ3-hoz (22., 24., 25., 30. hivatkozás). Továbbá úgy tűnik, hogy a nem kapcsolódó KCNQ-nyitók, például a cink-pirition, nem függnek a hidrogénkötés kölcsönhatásától, amelyet ebben a tanulmányban azonosítottunk 48. Ezért a különböző KCNQ csatorna altípusokhoz való gyógyszerkötés folyamatos vizsgálata segíthet további helyek feltárásában a KCNQ fokozásához.

Összefoglalva, természetellenes aminosav-mutagenezist és rendelkezésre álló retigabin-analógokat használtunk a retigabin-kötődés hatásainak lokalizálására a KCNQ3 Trp265 egyetlen H-kötés kölcsönhatásában. Ezek az eredmények rávilágítanak a gyógyszer kölcsönhatásának szokatlan módjára egy Trp oldallánccal, és bemutatják a gyógyszerkölcsönhatások mechanizmusának alapos vizsgálatának fontosságát a terápiás vegyületek racionális módosítása érdekében.

Mód

Molekuláris biológia és in vivo nonszensz elnyomás

Fluorozott Trp-származékokat (5-F1 -Trp; 7-F1 -Trp; 5, 7-F2 -Trp (F2 -Trp) és 5, 6, 7-F3 -Trp (F3 -Trp) az Asis Chem-től (Watertown, MA) és Sigma-Aldrich-től (St Louis, MO) vásároltuk. Az 'Ind' Trp variánst házon belül szintetizáltuk, amint azt korábban leírtuk, 31., 50. Természetellenes aminosavak beépítése ioncsatorna fehérjékbe amint azt a korábbi 29., 34., 51. publikációk részletesen leírják. Röviden: a természetellenes aminosavakat (aa) nitroveratriil-oxi-karbonil-csoporttal védettük és cianometil-észterként aktiváltuk, majd a pdCpA dinukleotidhoz kapcsoltuk (GE Healthcare/Dharmacon, Lafayette, CO). Ezt az aminoacil-dinukleotidot ezután egy módosított (G73) Tetrahymena termofil tRNS-hez ligáltuk. Az amino-acilezett tRNS-aa-t ultraibolya besugárzással eltávolítottuk a védőcsoportról közvetlenül az oocita injekció előtt. Tipikus kísérletben 80 ng tRNS-aa és 40 ng KCNQ3 A cRNS-t 50 nl térfogatban injektáltuk, kontroll kísérletekben a cRNS önmagában vagy a cRNS együtt th-tRNS-t injektáltunk pdCpA-hoz, de csatolt aminosav nélkül (ezeket a párhuzamos kontroll kísérleteket minden kísérleti napon elvégeztük, és az eredményeket az egész szövegben leírjuk).

Kételektródás feszültségbilincs felvételek

A feszültséggel kapcsolt káliumáramokat rögzítettük standard Ringers oldatban (mM-ben): 116 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, 5 HEPES (pH 7,4) OC-725C feszültség-szorítóval (Warner, Hamden, CT). . Az üveg mikroelektródákat visszatöltöttük 3 M KCl-tal, ellenállása 0,1–1 MΩ volt. Az adatokat 5 kHz-en szűrtük és 10 kHz-en digitalizáltuk a pClamp 10 szoftverrel (Molecular Devices) vezérelt Digidata 1440A (Molecular Devices) segítségével. A gyógyszereket a Toronto Research Chemicals-tól (retigabin) vagy a Tocris-tól (ML-213, flupirtin, ICA-069673, ICA-110381) vásároltuk, 100 mM készletben dimetil-szulfoxidban tároltuk, és minden kísérleti napon munkakoncentrációra hígítottuk.

A retigabin megkötésének molekuláris szimulációi

Adatelemzés

A csatorna aktiválásának feszültségfüggését egy standard egykomponensű Boltzmann-egyenlettel illesztettük, amelynek G/G max = 1/(1 + e− (V_V1/2)/k alakja volt, ahol V 1/2 az a feszültség, ahol a csatornák fele maximálisak aktiváció, és k egy lejtési tényező, amely tükrözi azt a feszültségtartományt, amely felett a Po e-szeres változása figyelhető meg. A koncentráció - retigabinra és származékaira adott válaszgörbék előállításához Δ V 1/2 (a fél aktiválási feszültség eltolódása) a maximális megfigyelt Δ V 1/2 értékre normalizáltuk, és megfelelt a következő egyenletnek: normalizált Δ V 1/2 = 1/(1 + EC 50/[gyógyszer]) A statisztikai teszteket és szignifikanciát az ábrákban a teljes leírás ismerteti. szöveg.

Kiegészítő információk

PDF fájlok

Kiegészítő információk

1. kiegészítő táblázat

Hozzászólások

Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja a közösségi feltételeket és irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.