suprabasalis

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • Az AP1 faktor suprabasalis inaktiválásának hatása az epidermális morfológiára
  • A TAM67 szuprabazális expressziója növeli az alapréteg keratinocitáinak proliferációját
  • A TAM67 suprabasalis expressziója blokkolja a tumor képződését
  • TAM67 kontra TPA: hasonló fenotípus
  • Vita
  • AP1 faktorok: kulcsfontosságú szerep a normális epidermiszben
  • Az AP1 faktor szuprabazális inaktiválásának hatása
  • Anyagok és metódusok
  • TAM67 transzgénikus egerek
  • Karcinogenitási vizsgálatok
  • Antitestek és immunológiai módszerek.
  • Szójegyzék

Tárgyak

  • Rák
  • Sejtszaporodás
  • Onkogenezis

Összegzés

Bevezetés

Feltételeztük, hogy az AP1 faktorok különböző funkciókat látnak el a bazális (proliferatív) versus suprabasalis (differenciáló) epidermiszben (Eckert et al., 2004). Ennek a hipotézisnek a tesztelését azonban bonyolítja az a tény, hogy az AP1 család gyakorlatilag minden tagja expresszálódik valamilyen szinten a bazális és suprabasalis rekeszekben (Welter és Eckert, 1995; Angel és mtsai, 2001; Mehic és mtsai. Al.) ., 2005). Az AP1 faktorok epidermális karcinogenezisben betöltött szerepének megértése érdekében Colburn és munkatársai a K14 promótert arra használták, hogy a TAM67 expresszióját a keratinociták alaprétegébe irányítsák (Young és mtsai, 1999). A TAM67 a c-jun domináns negatív formája, amely széleskörűen kölcsönhatásba lép az összes AP1 faktorral, hogy gátolja a transzaktivációt (Brown és mtsai., 1994). Ezekben az érdekes tanulmányokban az AP1 faktor inaktiválása az alaprétegben nem eredményezett nyilvánvaló változásokat a keratinocita proliferációjában vagy az epidermális vagy a bőr megjelenésében; az egerek azonban kevésbé voltak érzékenyek a rák progressziójára (Young és mtsai, 1999; Thompson és mtsai, 2002; Cooper és mtsai, 2003).

Jelen tanulmány egyik fontos célja az AP1 faktorok szerepének értékelése volt a suprabasalis epidermiszben. Ennek elérésére olyan egereket generáltunk, amelyekben a TAM67 a suprabasalis epidermális rétegekben expresszálódik. Olyan indukálható rendszert használunk, amely reverzibilisen lehetővé teszi a TAM67 expressziójának aktiválását a suprabasalis epidermiszben doxiciklin (Dox) ivóvízben történő beadásával. Kísérleteink azt mutatják, hogy a TAM67 szuprabazális expressziója megvastagodott, hiperproliferatív parakeratotikus epidermist eredményez, de ennek a kiterjedt hiperproliferációnak ellenére az epidermisz rezisztens a DMBA/TPA-függő tumor kialakulásával szemben.

Eredmények

Az AP1 faktor suprabasalis inaktiválásának hatása az epidermális morfológiára

Teljes méretű kép

A TAM67 szuprabazális expressziója növeli az alapréteg keratinocitáinak proliferációját

Az epidermális vastagság növekedése oka lehet a sejtek nagyobb túlélése a suprabasalis rétegekben, a sejtek nagyobb tapadása a rétegzett rétegekben, vagy a bazális sejtek nagyobb proliferációja. Először azt teszteltük, hogy az AP1 faktor szuprabazális inaktiválása befolyásolja-e a bazális keratinociták szaporodását. Ennek tesztelésére figyeljük a BrdU beépülését és a Ki67 szintet. A TAM67-et expresszáló egereket 2 órán át BrdU-val kezeltük, és szövetszelvényeket készítettünk a BrdU és Ki67 kimutatására. Amint a 2a. Ábra mutatja, a BrdU és Ki67 pozitív magok száma ötször nagyobb a TAM67 (+ Dox) pozitív epidermiszben, ami arra utal, hogy a bazális és suprabasalis réteg fokozott proliferációja hozzájárul a fenotípushoz.

Teljes méretű kép

A TAM67 szuprabazális expressziójának a sejtproliferációra és differenciálódásra gyakorolt ​​hatásának további értékeléséhez nyomon követtük az epidermális differenciálódási markerek expresszióját. A keratin K1, involucrin, filaggrin és loricrin jellemzően differenciált suprabasalis keratinocitákban expresszálódik (Eckert et al., 1997). A TAM67-pozitív epidermiszben a K1, az involucrin és a filaggrin normális suprabasalis expressziót mutat, ami arra utal, hogy a keratinocyták továbbra is differenciálódnak (2b. Ábra). Azonban a loricrint, amely normál esetben diszkrét sávként van jelen a felső hámrétegben, a TAM67-pozitív epidermiszben több suprabasalis rétegben diffúzan detektálják (2b. Ábra). Ezenkívül az AP1 faktor szuprabazális funkciójának hiánya az involucrin és a loricrin csökkent szintjével jár együtt (2c. Ábra); ami arra utal, hogy az AP1 faktor szuprabazális funkciója szükséges e gének expressziójának fenntartásához.

A K5 és K14 keratinok tipikusan bazális keratinocitákban expresszálódnak; azonban a TAM67 pozitív egerekben az expresszió mind a bazális, mind a suprabasalis rétegben megfigyelhető. Ezeknek a fehérjéknek a suprabasalis epidermiszben való jelenléte összhangban áll azzal az elképzeléssel, hogy a sejtek késik a differenciálódásban. Ezenkívül magas szintű keratin K6 expressziót észleltünk, amely keratin nem található meg a normál epidermiszben, de a hiperproliferatív epidermiszben (Sun és mtsai., 1983).

A TAM67 suprabasalis expressziója blokkolja a tumor képződését

TAM67-expresszáló tumorképződés a suprabasalis epidermisben. ( nak nek ) A suprabasalis TAM67-et expresszáló egerekben a tumor képződésének csökkenése. A TAM67-rTA egereket 100 µg DMBA egyetlen helyi alkalmazásával vagy anélkül kezeltük, majd 1 hét múlva Dox és TPA nélkül vagy anélkül kezeltük 22 hétig, az Anyagok és módszerek szerint. Az egereket hetente figyeltük meg a tumor kialakulása, száma és mérete szempontjából. Minden kezelési csoport tíz állatot tartalmazott. Az értékek átlag ± fél. 10-21. Héten a DMBA + TPA csoportban szignifikánsan több daganat volt a DMBA + TPA (+ Dox), P 2)/2 csoporthoz képest, csak a DMBA/TPA (± Dox) kezelt csoportokat mutatjuk be. Minden kezelési csoport tíz állatot tartalmaz, és az értékek átlag ± sem. A tumor mérete a 13-18. Héten szignifikánsan nagyobb volt a DMBA/TPA csoportban, mint a DMBA + TPA (+ Dox) csoportban, P

Válasz a TPA akut kezelésére. ( nak nek ) A suprabasalis TAM67 pozitív epidermisz hasonlít a TPA-val kezelt bőrre. A TAM67-rTA egereket ivóvízben, Dox-tal vagy anélkül 12 napig tartottuk, majd a TPA-t helyileg alkalmaztuk, amint azt jeleztük. 24 órás TPA kezelés után a szövetet összegyűjtöttük, és H&E festésre vagy a jelzett antitesttel történő inkubálásra szekcionáltuk. A fluoreszkáló képek 1 μm konfokális optikai szakaszok. ( b ) Az akut TPA-kezelés növeli a proliferációt a TAM67-pozitív epidermiszben. A TAM67-rTA egereket 12 napig a Dox diétán tartottuk. Az epidermist ezután 10 μg TPA/100 μl acetonnal tettük ki, és a szövetet 24 órával később összegyűjtöttük, és Ki67-vel festettük.

Teljes méretű kép

Ezután megvizsgáljuk, hogy az epidermiszben megfigyelt hiperproliferáció a szaruhártyán is kimutatható-e. Amint az 5a. Ábra mutatja, a TAM67-FLAG összehasonlítható szinten expresszálódik mind az epidermiszben, mind a szaruhártya hámjában. Az epidermisszel ellentétben azonban a TAM67 expressziója a szaruhártya-hámban nem okoz hiperproliferációt (5b. Ábra), ami arra utal, hogy a TAM67-függő hiperproliferáció csak bizonyos epitheliákban figyelhető meg.

Válasz hiánya a szaruhártya hámjában. ( nak nek, b ) A TAM67-FLAG magas szintű expressziója az egér szaruhártya-hámjában. A TAM67-rTA egereket 12 napon át Dox-tal vagy anélkül kezeltük, majd az epidermális és a szaruhártya-hámot összegyűjtöttük a TAM67-FLAG szintjének elemzése és a szövettani metszetek előkészítése céljából. Az immunoblot eredményeket a β-aktin detektálás alapján normalizáljuk (nem látható).

Teljes méretű kép

Vita

AP1 faktorok: kulcsfontosságú szerep a normális epidermiszben

Az AP1 transzkripciós faktor hálózat jun (c-jun, junB, junD) és fos tagokat tartalmaz (c-fos, FosB, Fra-1, Fra-2). Olyan jun-jun és jun-fos homodimereket és heterodimereket képeznek, amelyek kölcsönhatásba lépnek a konszenzusos DNS-kötő helyekkel a célgéneken a génexpresszió szabályozása érdekében. Az AP1 faktorok a jelátvitel kulcsintegrátorai az epidermiszben, amelyek közvetítik a citokinek, növekedési faktorok, differenciáló szerek és növekedésserkentők bejutását. Ezek a jelek a mitogénnel aktivált protein-kináz kaszkádon áramlanak, ami az AP1 faktor működésének károsodásához vezet. Az AP1 faktorok szabályozzák a keratinocita proliferációt (Takahashi és mtsai, 2002; Shi és Isseroff, 2005; Mizuno és mtsai, 2006), a differenciálódást (Eckert és mtsai, 2003, 2004; Adhikary és mtsai, 2004) és az apoptózist (Efimova et al., 2004; Raj et al., 2006), és fontosak a tumor progressziójában és a pikkelysömör kialakulásában (Kahn et al., 1993; Saez et al., 1995; Rutberg et al. al., 2000; Eckert et. al., 2002, 2003, 2004; Efimova és mtsai, 2002, 2003, 2004; She és mtsai, 2002; Iizuka és mtsai, 2004).

Az AP1 faktor szuprabazális inaktiválásának hatása

Jelen tanulmányban az AP1 faktor suprabasalis inaktiválásának hatását vizsgáljuk a keratinocita differenciálódásra és proliferációra. Modellként választottuk, a domináns-negatív c-jun (TAM67) expressziót a suprabasalis epidermiszre mutattuk. Ennek a megközelítésnek számos előnye van. Először is, a TAM67 zavarja az összes AP1 transzkripciós faktor működését (Brown és mtsai., 1994). Másodszor, az involucrin promoter használata lehetővé teszi a TAM67 irányítását a suprabasalis epidermiszbe, és enyhíti a knockout egereknél tapasztalt problémákat, ahol a fehérje minden rétegből elveszett. Harmadszor, létezik már a TAM67 alapréteget megcélzó modell (Young és mtsai, 1999, 2002; Thompson és mtsai, 2002; Cooper és mtsai, 2003; Matthews és mtsai, 2007), amely lehetővé teszi a hatás összehasonlítását az AP1 faktor szuprabazális inaktivációja.

Késleltetett differenciálódással összhangban a K5 és K14 keratinok, amelyek általában kizárólag az alaprétegben expresszálódnak, minden epidermális rétegben kimutathatók. Ez arra utal, hogy a K5 és K14 expresszió inaktiválásához szükséges események veszélybe kerülnek. Ezenkívül a K6 az összes epidermális rétegben expresszálódik. A K6 olyan keratin, amely hiperproliferatív körülmények között expresszálódik, de normál epidermiszben nem expresszálódik. A K6 kifejeződik pikkelysömörben, a phorbol-észterrel kezelt epidermiszben és a keratinocita hiperproliferációval járó egyéb állapotokban (Sun et al., 1984; Heyden et al., 1994a, 1994b; Iizuka et al., 2004). Így a TAM67 szuprabazális expressziója a bazális réteg fokozott proliferációjához és késleltetett differenciálódáshoz vezet, és végül kiterjedt hiperkeratózist eredményez.

A hiperproliferatív fenotípus miatt arra számítunk, hogy a suprabasalis TAM67 egerek hajlamosak a tumor kialakulására. DMBA-val kezelt TAM67 pozitív vagy negatív egerekben nem alakult ki daganat; a DMBA/TPA-val végzett kezelés azonban tumor kialakulást eredményezett. Meglepő volt megállapítani, hogy a DMBA/TPA-függő daganatképződés jelentősen csökkent a suprabasalis TAM67 egerekben. Ez azt sugallja, hogy bár a TAM67 fokozott epidermális proliferációhoz vezet, ez nem jelent megnövekedett tumorképződést. Figyelembe vesszük annak lehetőségét, hogy a TAM67 zavarhatja a TPA proliferációt elősegítő aktivitását a karcinogenezis protokollban. Kísérleteink azonban azt sugallják, hogy a TAM67-et expresszáló epidermisz teljes mértékben képes reagálni a TPA-ra. A TAM67-pozitív epidermiszben ötször több Ki67-pozitív bazális sejt van, és a legtöbb suprabasalis sejt is pozitív.

Ezek a tanulmányok azt mutatják, hogy a TAM67 egyértelműen befolyásolja az epidermális funkciót. Érdekes azonban, hogy a TAM67 expressziója nem befolyásolja a szaruhártya hámját (5. ábra). Ez a megállapítás azt sugallja, hogy nem minden szövet képes reagálni az AP1 működésének megzavarására. Nem világos, hogy a szaruhártya-hám miért lenne ellenálló a TAM67-interferenciával szemben az AP1 faktor működésével szemben, de érdekes, hogy a szaruhártya-hám rendkívül ellenálló a rákkal szemben (Cutler, 2004).

Anyagok és metódusok

TAM67 transzgénikus egerek

Karcinogenitási vizsgálatok

Antitestek és immunológiai módszerek.